بررسی ایمنی زایی ژنهای L7L12 و P39 در موشهای Balac 65ص

توجه : این پروژه فقط به صورت فایل (با پسوند) zip ارائه میگردد
تعداد صفحات فایل : ۵۹

تعداد صفحات : ۵۹ صفحه

فصل دوم هدف از این تحقیق بررسی ایمنی زایی ژنهای L7/L12 و P39 در موشهای Balac است.
بنابراین پس از جداسازی و تکثیر ژنهای فوق مراحل زیر در این تحقیق انجام گرفت.
۱- لکون نمودن ژنهای فوق در یک ناقل انتقال دهنده Cleaning vector 2- تعیین ترادف نوکلئوتیدی ژنهای جداشده و مقایسه آن با ژنهای L7/L12 3- کلون نمودن ژنها در پلاسمید بیان کننده پروکاریونی Procaryotic expression vector 4- تولید و تخلیص پروتئینهای L7/L12 و P39 5- کلون نمودن آنها در پلاسمید بیان کننده اوکاریوتی Eucaryotic expression vector 6- هاری کردن پلاسمیدهای فوق از آندوتوکسین ۷- تزریق پلاسمیدها، بسویه واکنش و سویه بیماریزا بروسلاآبورتوس به موش Balb/C 8- سنجشهای ایمونولوژیک باکتریها و پلاسمیدهایی که برای انجام این پایان نامه استفاده دشه اند بترتیب زیر می باشند: باکتریها: بروسلاآبورتوس سویه های ۱۹S و ۵۴۴ اشدیشیالکی سویه

اشریشیالکی سویه BL21 – اشریشیاکی سویه BL21(DE3(Plyss پلاسمیرها: PGEX4T1 – PRT 28a – SK+(pSK) – Pblue Script-PCDNA3 جداسازی کروموزوم بروسلا آبورتوس ۱۹S: برای تکثیر ج داسازی ژنهای L7/L12 و P39 ابتدا کروموزوم باکتری جداسازی گردید.
مواد: بافر TE: Tris – Hel ۱۰mm EDTA ۱.
0mm ‍PH بافر را پس از تهیه برروی ۸ تنظیم می نمائیم.
پروتئیناز K: CTAB/NaCl: Nacl ۴.
۱gr CTAB ۱۰gr DDW ۱۰۰ml (Final Volume) روش: ابتدا محیط برنسط برات را تهیه و استریل نموده و ml5 از محیط را با بروسط آبورتوس سویه ۱۹S تلقیح می نمائیم.
پس ۴۸ تا ۷۲ ساعت باکتریها رشد کرده و کدورت مناسبی را پیدا می کند.
بقیه مراحل تخلیص کروموزوم بشرح زیر است: ۱- ۵/۱ میلی لیتر از سوسپاستیون فوق را مدت ۲ دقیقه در rpm5000 سانتریفوژ می نمائیم.
محلول رویی را دور می ریزیم.
۲- Ml576 از بافر TE را بر روی رسوب باکتری اضافه کرده و رسوب را در بافر حل می نمائیم.
سپس ml30 از SDS(10%) و ml3 از پروئیناز K (mg/ml20) را افزوده و بمدت یکساعت در دمای 0C37 نگهداری می نمائیم.
۳- پس از مخلوز Ml100 از (M5)NaCl از محلول CTAB/NaCl بمیزان Ml80 اضافه کرده و بمدت ۱۰ دققیق در 0C65 انکوبه می کنیم.
۴- هم حجم مخلوط بالا از ترکیب کلروفرم – ایزوآمیل (۱/۲۴) به مخلوط افزوده و سپس از مخلوط بمدت ۵ دقیقه در rpm10000 سانترفوژ می کنیم.
محلول رویی را به لوله دیگر منتقل می نمائیم.
۵- هم حجم محلول روئی ترمیب فنل – کلروفرم – ایزوآمیل (۱/۲۴/۲۵) پس از مخلوط بمدت ۵ دقیقه در vpr10000 سانتریفوژ کرده و محلول رویی به لوله دیگری منتقل می نمائیم.
۶- هم حجم محلول روئی ایزوپروپانل اضافه نموده و مخلوط می کنیم.
پس از چند دقیقه DNA کروموزومی ته نشین شده که می توان بات یک پیپت پاستور آنرا جمع آوری نمائیم.
۷- رسوب DNA کروموزومی را با الکل ۷۰% شستشو داده و پس از خشک شدن در مجاورت هوا در Ml100 از بافر TE حل می نمائیم.
بررسی کمی و کیفی DNA کروموزومی: برای تعیین خلوط کروموزوم باکتری از مواد و وسایل زیر استفاده میشود.
۱- بافر PBE pH=8(10X) Tris – base ۸۹۰mM Boric Acid ۸۹۰mM EDTA ۲۵mM 2- آگارز MP 3- تانک الکتروفورز افقی روش: ابتدا آگارز MP در بافر TBE(0.
۵x) را بکم