دانش رسان |
مرکز علم و دانش کشور مقاله جداسازی متابولیتهای ثانویه طی فرآیند استخراج DNA از گیاه آویشن و آنالیز آنها با روش GC-Mass
در حال بارگذاری
توجه : به همراه فایل word این محصول فایل پاورپوینت (PowerPoint) و اسلاید های آن به صورت هدیه ارائه خواهد شد
مقاله جداسازی متابولیتهای ثانویه طی فرآیند استخراج DNA از گیاه آویشن و آنالیز آنها با روش GC-Mass دارای ۱۲ صفحه می باشد و دارای تنظیمات در microsoft word می باشد و آماده پرینت یا چاپ است
فایل ورد مقاله جداسازی متابولیتهای ثانویه طی فرآیند استخراج DNA از گیاه آویشن و آنالیز آنها با روش GC-Mass کاملا فرمت بندی و تنظیم شده در استاندارد دانشگاه و مراکز دولتی می باشد.
توجه : در صورت مشاهده بهم ریختگی احتمالی در متون زیر ،دلیل ان کپی کردن این مطالب از داخل فایل ورد می باشد و در فایل اصلی مقاله جداسازی متابولیتهای ثانویه طی فرآیند استخراج DNA از گیاه آویشن و آنالیز آنها با روش GC-Mass،به هیچ وجه بهم ریختگی وجود ندارد
بخشی از متن مقاله جداسازی متابولیتهای ثانویه طی فرآیند استخراج DNA از گیاه آویشن و آنالیز آنها با روش GC-Mass :
مقدمه
داروهای شیمیایی با وجود کارآیی که دارند اما دارای اثرات نامطلوب فراوانی هم هستند، این موضوع باعث شده محققین به مواد طبیعی (که دارای اثرات نامطلوب کمتری هستند) بیشتر توجه نمایند. امروزه در اکثر کشورها از گیاهان دارویی در فرآیندهای درمانی استفادههای مختلفی میشود .(۱۲)
آویشن یکی از گیاهان دارویی مهم در ایران است که در طب سنتی و مدرن کاربرد فراوان دارد .(۲۰) جنس آویشن
(Thymus)، یکی از جنسهای خانواده نعناعیان
(Lamiaceae) است که در زیرخانواده Nepetoideae قرار دارد .(۱۹) با توجه به اهمیت این گیاه در صنایع دارویی، محققان به دنبال آن میباشند که با استفاده از فنآوریهای زیستی علاوه بر مطالعات پایه (از قبیل شناسایی گونهها و تاکسونومی)، به کاربردهای زیستی تولید داروها و مهندسی متابولیک آن بپردازند.
همانند بسیاری از فنآوریهای دیگر، زیستفناوری دارای مزایای زیادی میباشد و با توجه به نیاز فراوان به این رشته، هر روز شاهد ظهور فنون جدید آزمایشگاهی یا
۶۶
مجله پژوهشهای سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران) جلد ۲۷، شماره ۱، ۱۳۹۳
بهبود فنون قبلی در مطالعات و پژوهشهای این رشته می توان بود. یکی از مهم ترین تکنیکهای پایه در علوم
DNA نوترکیب و مهندسی ژنتیکی و سایر مطالعات ژنتیکی، استخراج DNA است و شاید بتوان گفت استخراج اسیدهای نوکلئیک اولین گام در انجام اینگونه مطالعات است .(۱) از آنجایی که در اکثر فنون آزمایشگاهی از تکنیک واکنش زنجیرهای پلیمراز (PCR) برای آنالیز DNA
استخراج شده استفاده میشود و با توجه به حساسیت زیاد این سیستم به یک الگو با کیفیت و کمیت مناسب (۷) نیاز به بهینهسازی روش استخراج احساس میشود. وجود ترکیبات بازدارنده در محلول DNA استخراج شده باعث جلوگیری از فعالیت آنزیمهای تک پلیمراز در واکنش زنجیرهای پلیمراز (PCR) و همچنین مانع عمل آنزیمهای برشگر میشود .(۹) روشهایی که نیاز به تجهیزات پیشرفته آزمایشگاهی نداشته باشد و با هزینه کمتری بتوان DNA
قابل استفاده از لحاظ کمی و کیفی بهدست آورد، بسیار مورد اهمیت است. با وجود اینکه ایده اصلی پشت استخراج DNA خیلی پیچیده نیست، دستورالعملهای مختلف استخراج DNA برای گونههای خاصی پیشنهاد شده است و دستورالعملهای منتشر شده لزوماً قابل استفاده برای همه گونهها نیست .(۲۱) مشکلی که عمدتاً در طی استخراج رخ میدهد این است که ترکیباتی از قبیل پلی-
ساکاریدها و ترکیبات فنلی به شکل کمپلکس با اسیدهای نوکلئیک باند میشوند (۲۳)، که تغییر در pH و ترکیب بافر استخراج توانسته است در بهبود کمیت و کیفیت
DNA استخراج شده تا حدودی موثر باشد .(۱۸)
تحقیقات متعددی جهت بهینهسازی روش استخراج صورت گرفته است بهطور مثال شلفرد و همکارانش
(۲۰۰۲) دستورالعملهای استخراج را در سه گونه مختلف با بافتهای تازه و فریز شده مقایسه نمودند و دریافتند که بافتهای فریز شده دارای غلظت DNA بیشتری هستند
.(۲۲) امام جمعه و همکاران (۲۰۰۶)، چهار روش استخراج DNA ژنومی را در Agaricus bisporus با هم
مقایسه کردند، این محققین هر چهار روش را مناسب دانستند و پیشنهاد دادند که هر پژوهشگر براساس امکانات آزمایشگاهی دردسترس، یکی از روشها را انتخاب نماید
.(۱۴) در تحقیقی دیگر جهت بهینهسازی استخراج DNA
از گیاهان دارویی که در مناطق مختلف ترکیه رشد میکنند چهار روش مورد آزمون قرار گرفت و نتیجه گرفته شد هنگامی که از گیاهان بالغ استفاده می شود هیچکدام از روشها نتیجه مطلوبی را بهدست نمیدهد و این به علت وجود متابولیتهای ثانویه در این نوع گیاهان میباشد
.(۲۵)
در اکثر منابعی که مورد بررسی قرار گرفت مشخص شد که استخراج از بافتهای جوان به مراتب نتایج بهتری را نسبت به وقتی که بافت پیر بوده ارائه میدهد ۱۰)، ۱۷ و (۲۶؛ اما در مواقعی محقق براساس نوع تحقیق و یا به اجبار باید از سطح طبیعت و یا مزرعه نمونهبرداری کند که در این حالت اکثر گیاهان به گل رفته و متابولیتهای ثانویه زیادی در گیاه تولید شدهاند. این موضوع سبب میشود کیفیت مطلوبی در حین استخراج DNA مشاهده نشود.
بنابراین در این تحقیق به بررسی و بهینهسازی روشی مناسب و مطلوب برای گیاه بالغ آویشن پرداخته شد تا بتوان به یک روش مناسب جهت استخراج DNA آن دست یافت و آن را به دیگر گیاهان بالغ هم تعمیم داد. در این مطالعه از چهار روش مختلف استخراج استفاده گردید.
همچنین رسوبهای بهدست آمده در روشهای مختلف جهت درک بهتر از ماهیت مواد موجود در آنها مورد آنالیز فیتوشیمیایی قرار گرفت.
مواد و روشها
مواد گیاهی: نمونههای مورد بررسی از مزرعه تحقیقاتی مؤسسه تحقیقات جنگلها و مراتع کشور جمعآوری شد.
نمونهها همه از گیاهان بالغ و به گل رفته انتخاب گردید.
برگهای گیاهان پس از شستشو با آب مقطر توسط ازت مایع پودر و به آزمایشگاه تحقیقاتی دانشکده کشاورزی
۶۷
بررسی کمیت و کفیت DNA
مجله پژوهشهای سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران) جلد ۲۷، شماره ۱، ۱۳۹۳
دانشگاه لرستان منتقل و درون میکروتیوپ در دمای -۸۰
درجه سانتیگراد تا زمان استخراج نگهداری شد.
استخراج :DNA در این تحقیق، روشهای مختلف استخراج شامل، دویل و دویل (۱۳)، دلاپورتا (۱۱)، کانگ و یانگ
(۱۵) و خانوجا (۱۷) با توجه به کمیت و کیفیت DNA
مورد مقایسه قرار گرفتند. در ادامه یک روش دیگر که مشابه روش خانوجا ولی با کمی تغییرات بود هم مورد آزمون قرار گرفت. در روش خانوجای تغییریافته، تعداد دورهای سانتریفیوژ متفاوت از دستورالعمل اصلی انتخاب گردید (مرحله اول ۸۰۰۰ دور، مرحله دوم ۱۰۰۰۰ دور)؛
همچنین اولین رسوب DNA بهدست آمده، با الکل ۸۰
درصد همراه با سانتریفیوژ در ۱۰۰۰ دور در دقیقه به مدت
۳ دقیقه در دمای ۴ درجه سانتیگراد شستشو داده شد و بعد از خشک کردن رسوب به جای بافر TE با نمک بالا، در آب مقطر دو بار استریل حل گردید. از آنجا که انجام مراحل بعدی پروتکل موجب تشکیل رسوب ژلاتینی
DNA شد بهگونهای که پس از غلظتسنجی نمونهها، مقدار DNA بهدست آمده کمتر و از کیفیت مطلوبی برخوردار نبود استخراج در این مرحله به پایان رسانده شد که این کار موجب کوتاه تر شدن مدت زمان استخراج گردید. با توجه به نقش NaCl در استخراج DNA خالص
۳) و (۲۶، در این روش علاوه بر بافر استخراج که شامل NaCl غلیظ ۵) مولار) بود، در مرحله افزودن ایزوپروپانول هم مجدداً از NaCl غلیظ ۵) مولار) استفاده گردید.
استخراج شده: با استفاده از
الکتروفورز DNA بر روی ژل آگارز ۰/۸ درصد و مقایسه تراکم نوارهای DNA هر نمونه با تراکم نوارهای نشانگر کیفیت باند DNA هر نمونه مشخص شد. برای هر نمونه ۸
میکرولیتر DNA استخراج شده با ۲ میکرولیتر بافر بارگذاری مخلوط شد و در چاهکهای ژل آگارز در شرایط بافری TAE تخلیه گردید و با اعمال ولتاژ ثابت ۹۰ ولت به مدت ۶۰ دقیقه الکتروفورز گردید
به منظور بررسی کمیت DNA استخراج شده از دستگاه بیوفتومتر استفاده گردید. در ابتدا جهت بالا بردن دقت دستگاه غلظت DNA نمونهها کاهش داده شد. بدین منظور غلظت نمونهها با نسبت ۵ به ۱۹۵ آب مقطر استریل تنظیم گردید و بعد از بلانک دستگاه با آب مقطر استریل، نسبت جذب ۲۶۰ به ۲۸۰ و غلظت DNA بر اساس نانوگرم در میکرولیتر قرائت گردید.
آنالیز فیتوشیمیایی: در روش خانوجای تغییریافته گیاهانی که بافت پودر شده آنها خشبیتر بودند، بلافاصله بعد از افزودن نمک در مرحله انکوبه کردن با ایزوپروپانول، در ویال حاوی محلول DNA، رسوب چسبناک قهوهای رنگی تشکیل میشد که در سایر روشها مشاهده نگردید. بنابراین، این رسوب مورد بررسی قرار گرفت، تا ترکیبات موجود در آن شناسایی شوند.
به دلیل اینکه رسوبهای قهوهای رنگ به دست آمده از لحاظ رنگ و نمونه مورد بررسی با هم متفاوت بودند، هر رسوب بهطور جداگانه نگهداری گردید. در ابتدا ۱۰
رسوب مختلف از لحاظ رنگ به طور تصادفی انتخاب گردید. تست حلالیت برای آنها به وسیله ۱۰ حلال مختلف
(متانول، اتانول، دی متیل فرم آمید، پروپانول، اتر، کلروفرم، اتیل استات، تترا هیدرو فوران، تولوئن و آب مقطر) انجام شد. با وجود اینکه تمام این حلالها تا حدودی توانستند رسوب را در خود حل کنند اما جهت بررسیهای بعدی از حلال آب مقطر استفاده شد که کار با آن سادهتر بود.
بنابراین نمونهها با آب مقطر به حجم ۲۵ میلیلیتر رسانده و طیف UV آنها با استفاده از دستگاه UV- (SHIMADZU) Visible گرفته شد. سپس برای تعیین کیفی و گروههای عاملی موجود در این رسوبها، طیف IR آنها با استفاده از دستگاه IR (SHIMADZU) به دست آمد. برای این منظور ابتدا ۰/۰۱ میلیگرم از رسوب همراه با ۰/۰۲ میلیگرم از ماده KBR در هاون به خوبی با هم مخلوط گردید، سپس توسط دستگاه پرس به صورت قرص درآورده و از قرص
۶۸
مجله پژوهشهای سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران) جلد ۲۷، شماره ۱، ۱۳۹۳
حاصل طیف گرفته شد. در انتها برای تعیین نوع مواد و میزان مواد موجود در رسوب از نمونهها طیف GC-Mass
گرفته شد. برای این کار ابتدا ۰/۰۰۱ میلیگرم از رسوب را در متانول حل کرده و به میزان ۲ میکرولیتر از محلول توسط سرنگهای خاص به دستگاه تزریق گردید و طیف آن به دست آمد.
نتایج و بحث
از بین روشهای مورد آزمون روش خانوجا با اندکی تغییرات نتایج بهتری را نشان داد. کیفیت DNA استخراج شده در این روش از روشهای دیگر بالاتر بود (شکل .(۱
این روش بهینه شده به نوعی ترکیبی چند روش متداول میباشد. استفاده از روشهای ترکیبی میتواند نتایج بهتری را نسبت به روشهای متداول داشته باشد .(۵)
اشتراک‌گذاری:
- در صورتی که به هر دلیلی موفق به دانلود فایل مورد نظر نشدید با ما تماس بگیرید.
