مقاله در مورد اندازه گیری زیرالنون به روش کروماتوگرافی لایه نازک

توجه : به همراه فایل word این محصول فایل پاورپوینت (PowerPoint) و اسلاید های آن به صورت هدیه ارائه خواهد شد

 مقاله در مورد اندازه گیری زیرالنون به روش کروماتوگرافی لایه نازک دارای ۳۲ صفحه می باشد و دارای تنظیمات در microsoft word می باشد و آماده پرینت یا چاپ است

فایل ورد مقاله در مورد اندازه گیری زیرالنون به روش کروماتوگرافی لایه نازک  کاملا فرمت بندی و تنظیم شده در استاندارد دانشگاه  و مراکز دولتی می باشد.

توجه : در صورت  مشاهده  بهم ریختگی احتمالی در متون زیر ،دلیل ان کپی کردن این مطالب از داخل فایل ورد می باشد و در فایل اصلی مقاله در مورد اندازه گیری زیرالنون به روش کروماتوگرافی لایه نازک،به هیچ وجه بهم ریختگی وجود ندارد

بخشی از متن مقاله در مورد اندازه گیری زیرالنون به روش کروماتوگرافی لایه نازک :

آشنایی با مؤسسه استاندارد و تحقیقات صنعتی ایران
مؤسسه استاندارد و تحقیقات صنعتی ایران به موجب قانون، تنها مرجع رسمی کشور است که عهده دار وظیفه تعیین، تدوین و نشر استانداردهای ملی (رسمی) میباشد.
تدوین استاندارد در رشته های مختلف توسط کمیسیون های فنی مرکب از کارشناسان مؤسسه، صاحبنظران مراکز و مؤسسات علمی، پژوهشی، تولیدی واقتصادی آگاه ومرتبط با موضوع صورت میگیرد. سعی بر این است که استانداردهای ملی، در جهت مطلوبیت ها و مصالح ملی وبا توجه به شرایط تولیدی، فنی و فن آوری حاصل از مشارکت آگاهانه و منصفانه صاحبان حق و نفع شامل:

تولیدکنندگان ،مصرف کنندگان، بازرگانان، مراکز علمی و تخصصی و نهادها و سازمانهای دولتی باشد.پیش نویس استانداردهای ملی جهت نظرخواهی برای مراجع ذینفع واعضای کمیسیون های فنی مربـوط ارسال میشود و پس از دریـافت نظـرات وپیشنهادهـا در کـمیته ملـی مرتبـط بـا آن رشته طرح ودر صورت تصویب به عنوان استاندارد ملی (رسمی) چاپ و منتشر می شود.

پیش نویس استانداردهایی که توسط مؤسسات و سازمانهای علاقمند و ذیصلاح و با رعایت ضوابط تعیین شده تهیه می شود نیز پس از طرح و بـررسی در کمیته ملی مربوط و در صورت تصویب، به عنوان استاندارد ملی چاپ ومنتشرمی گردد. بدین ترتیب استانداردهایی ملی تلقی می شود که بر اساس مفاد مندرج در استاندارد ملی شماره ((۵)) تدوین و در کمیته ملی مربوط که توسط مؤسسه تشکیل میگردد به تصویب رسیده باشد.
مؤسسه استاندارد و تحقیقات صنعتی ایران از اعضای اصلی سازمان بین المللی استاندارد میباشد که در تدوین استانداردهای ملی ضمن تـوجه به شرایط کلی ونیازمندیهای خاص کشور، از آخرین پیشرفتهای علمی، فنی و صنعتی جهان و استانداردهـای بین المـللی استفـاده می نماید.
مؤسسه استاندارد و تحقیقات صنعتی ایران می تواند با رعایت موازین پیش بینی شده در قانون به منظور حمایت از مصرف کنندگان، حفظ سلامت و ایمنی فردی وعمومی، حصول اطمینان از کیفیت محصولات و ملاحظات زیست محیطی و اقتصادی، اجرای بعضی از استانداردها را با تصویب شورای عالی استاندارد اجباری نماید. مؤسسه می تواند به منظور حفظ بازارهای بین المللی برای

محصولات کشور، اجرای استاندارد کالاهای صادراتی و درجه بندی آنرا اجباری نماید.
همچـنین بمنظـور اطـمینان بخـشیدن به استفاده کنندگـان از خـدمات سازمانها و مؤسسات فعال در زمینه مشاوره، آموزش، بازرسی، ممیزی و گواهی کنندکان سیستم های مدیریت کیفیت ومدیریت زیست محیطی، آزمایشگاهها و کالیبره کنندگان وسایل سنجش، مؤسسه استاندا

رد اینگونه سازمانها و مؤسسات را بر اساس ضوابط نظام تأیید صلاحیت ایران مورد ارزیابی قرار داده و در صورت احراز شرایط لازم، گواهینامه تأیید صلاحیت به آنها اعطا نموده و بر عملکرد آنها نظارت می نماید. ترویج سیستم بین المللی یکاها ، کالیبراسیون وسایل سنجش تعیین عیار فلزات گرانبها و انجام تحقیقات کاربردی برای ارتقای سطح استانداردهای ملی از دیگر وظایف این مؤسسه می باشد.

کمیسیون استاندارد”خوراک دام- اندازه گیری زیرالنون به روش کروماتوگرافی لایه نازک- روش آزمون”
رئیس سمت یا نمایندگی
شجاعی،فریبرز ( دکتری فارموکینتیک ) شرکت مرجعان خاتم
اعضا
آرین نمازی،حسین( لیسانس کشاورزی ) شرکت دیهیم کویر
بنائی،بهداد ( مهندسی شیمی صنایع غذایی ) شرکت آتی نگران پیشگام
حافظی اردکانی،پرتو ( لیسانس شیمی ) اداره کل استاندارد و تحقیقات صنعتی استان کرمان
خالقی،موج ( فوق لیسانس میکروبیولوژی ) اداره کل استاندارد و تحقیقات صنعتی استان کرمان
دهقانی،فاطمه ( لیسانس شیمی ) اداره کل استاندارد و تحقیقات صنعتی استان کرمان

گلشن،ابوالفضل( فوق لیسانس علوم و صنایع غذایی ) مرکز تحقیقات کشاورزی استان کرمان
مشکانی،اعظم السادات( لیسانس زیست شناسی ) شرکت مرجعان خاتم
مظاهری،منصوره(فوق لیسانس مهندسی شیمی بیوتکنولوژی ) موسسه استاندارد و تحقیقات صنعتی ایران
نوروزی،سعید ( دکتری دامپزشکی ) موسسه استاندارد و تحقیقات صنعتی ایران

نوری،نغمه( لیسانس صنایع غذایی ) کارخانه فرآورده های لبنی و دامداری هامون
دبیر
علائی،آناهیتا ( فوق لیسانس شیمی ) اداره کل استاندارد و تحقیقات صنعتی استان کرمان
پیش گفتار
استاندارد”خوراک دام – اندازه گیری زیرالنون به روش کروماتوگرافی لایه نازک- روش آزمون”که توسط کمیسیونهای مربوط تهیه و تدوین شده و در چهارصدوهجدهمین جلسه کمیته ملی استاندارد خوراک و فرآورده های کشاورزی مورخ ۱۶/۱۲/۸۲ مورد تصویب قرار گرفته است، اینک به استناد بند یک ماده ۳ قانون اصلاح قوانین و مقررات موسسه استاندارد و تحقیقات صنعتی ایران مصوب بهمن ماه ۱۳۷۱ بعنوان استاندارد ملی ایران منتشر می شود.
برای حفظ همگامی و هماهنگی با تحولات و پیشرفت های ملی و جهانی در زمینه صنایع، علوم و خدمات، استانداردهای ملی ایران در مواقع لزوم تجدید نظر خواهد شد و هر گونه پیشنهادی که برای اصلاح یا تکمیل این استانداردها ارائه شود، در هنگام تجدید نظر در کمیسیون فنی مربوط مورد توجه قرار خواهد گرفت . بنابراین برای مراجعه به استانداردهای ایران باید همواره از آخرین تجدید نظر آنها استفاده کرد.
در تهیه و تدوین این استاندارد سعی شده است که ضمن توجه به شرایط موجود و نیازهای جامعه

در حد امکان بین این استاندارد و استاندارد ملی کشورهای صنعتی و پیشرفته هماهنگی ایجاد شود.
منبع و ماخذی که برای تهیه این استاندارد به کار رفته به شرح زیر است:
۱- ISO 6870: 1985(E) Animal feeding stuffs – Determination of zearalenone content

خوراک دام – اندازه گیری زیرالنون به روش کروماتوگرافی لایه نازک۱- روش آزمون
۱ هدف
هدف از تدوین این استاندارد، تعیین روش برای اندازه گیری زیرالنون در خوراک دام ( به ویژه ذرت ) می باشد.
یادآوری – اگر چه نقاط فلورسانسی که سورگام۲ ایجاد می کند مشابه با زیرالنون است ولی هنوز از این روش برای اندازه گیری زیرالنون در خوراک دام استفاده می شود، زیرا مقادیر ۳ پس از ظهور کروماتوگرام در جهت دوم متفاوت هستند. این نقاط فلورسانس سورگام با روش های تاییدی مشخص شده در این استاندارد خاص ظاهر نمی شوند.

۲ دامنه کاربرد
حد تعیین مقدار۴ برابر ۵۰ میکروگرم بر کیلوگرم می باشد.

۳ مراجع الزامی
مدارک زیر حاوی مقرراتی است که در متن این استاندارد به آنها ارجاع داده شده است. بدین ترتیب آن مقررات جزئی از این استاندارد محسوب می شود. در مورد مراجع دارای تاریخ چاپ و/ یا تجدیدنظر، اصلاحیه ها و تجدیدنظرهای بعدی این مدارک مورد نظر نیست. معهذا بهتر است کاربران ذینفع این استاندارد ، امکان کاربرد آخرین اصلاحیه ها و تجدیدنظرهای مدارک الزامی زیر را مورد

بررسی قرار دهند. در مورد مراجع بدون تاریخ چاپ و/ یا تجدیدنظر، آخرین چاپ و/ یا تجدیدنظر آن مدارک الزامی ارجاع داده شده مورد نظر است.
استفاده از مراجع زیر برای کاربرد این استاندارد الزامی است:
۳-۱ استاندارد ملی ایران ۳۰۲۱ : سال ۱۳۷۴ خوراک دام-آماده سازی نمونه آزمایشگاهی.
۳-۲ استاندارد ملی ایران ۲۷۰۷ : سال ۱۳۸۱ آفلاتوکسین های گروه M,G,B- روش آزمون-تعیین غلظت و درجه خلوص به روش اسپکتروفتومتری.
۳-۳ استاندارد ملی ایران ۵۹۲۵ : سال۱۳۸۰ خوراک انسان- دام -بیشینه رواداری مایکوتوکسین ها.
۳-۴ ISO 5725-1,2 :1994 Accuracy ( trueness and precision ) of measurement methods and results.
۳-۵ ISO 6497: 2002 Animal feeding stuffs- Sampling
۴ اصطلاحات و تعاریف
در این استاندارد اصطلاحات و/ یا واژه ها با تعاریف زیر به کار می رود:
۴-۱ زیرالنون
سمی است که عمدتا توسط گونه هایی از قارچ فوزاریوم۱ مانند: فوزاریوم گرامیناروم۲ و فوزاریوم کالموروم۳ ،تولید می گردد.
۴-۲ کروماتوگرافی لایه نازک
کروماتوگرافی روشی برای جداسازی اجزای یک مخلوط می باشد. در این روش کروماتوگرافی، فاز ساکن شامل ذرات جاذب سیلیکاژل، آلومینا و فلوریزیل است، که روی یک صفحه نازک پوشش داده شده است. فاز متحرک با عبور از فاز ساکن بر اساس خاصیت مویینگی موجب جداسازی اجزای یک مخلوط می گردد.
۴-۳ نمونه شاهد
به نمونه ای گفته می شود، که بدون آلودگی به زیرالنون بوده و تمامی مراحل این آزمون را برای کسب اطمینان از عدم آلودگی، بر روی آن انجام شده باشد.
۴-۴ تخلیص

به حذف چربی، پیگمان رنگی و یا مواد مداخله گر موجود در نمونه استخراج شده، گفته می شود.
۴-۵ استخراج۱
به جداسازی سم از نمونه مورد آزمون از طریق انحلال سم در یک حلال و یا مخلوطی از حلال های مناسب، گفته می شود.
۴-۶ صحت۲
به نزدیکی یا توافق بین نتایج آزمون با میزان واقعی که در نمونه وجود دارد، گفته م

ی شود.
۴-۷ دقت۳
به نزدیکی یا توافق بین نتایج آزمون های مستقل، که تحت شرایط مقرر شده انجام شده باشد، گفته می شود.
تکرارپذیری۱ و تجدیدپذیری۲، روش هایی برای تعیین دقت روش آزمون می باشد.
۴-۸ تکرارپذیری ( r )
به نزدیکی یا توافق بین نتایج حاصل از تجزیه مکرر یک نمونه به وسیله یک روش آزمون، تحت شرایط مشابه در زمان های نزدیک به هم، گفته می شود.
۴-۹ تجدیدپذیری ( R )
به نزدیکی یا توافق بین نتایج حاصل از تجزیه مکرر یک نمونه که به وسیله یک روش آزمون،تحت شرایط مختلف مانند: آزمایش کننده، دستگاه و آزمایشگاه انجام شده باشد، گفته می شود.
۴-۱۰ آماده سازی نمونه۳
به همه کارهایی گفته می شود، که پیش از انجام آزمون روی نمونه آزمایشگاهی صورت می گیرد، مانند: آسیاب کردن، مخلوط کردن، یکنواخت کردن، پخش کردن و ; .
۴-۱۱ نمونه آزمایشگاهی۴
به بخشی از نمونه که برای آماده سازی و انجام آزمون به آزمایشگاه فرستاده می شود،گفته می شود.
۴-۱۲ آزمایه۵
به بخشی از نمونه آزمایشگاهی که برای انجام آزمون آماده شده است، گفته می شود.
۴-۱۳ آزمونه۱
بخشی از آزمایه است، که آزمایش بر روی آن انجام می گیرد.
۴-۱۴ محلول استاندارد کاری زیرالنون
محلولی استاندارد از زیرالنون در بنزن است، که غلظتی برابر با ۱۰ میکروگرم در میلی لیتر داشته باشد.

۵ مواد لازم
تمام مواد و معرف های مورد استفاده بایستی دارای درجه خلوص تجزیه ای بوده و آب مورد استفاده در آزمایش، باید آب مقطر و یا با خلوص مشابه با آن باشد.
۵-۱ استونیتریل
۵-۲ ایزو – اکتان
۵-۳ کلروفرم

۵-۴ بنزن – استونیتریل ( ۲ + ۹۸ )
۹۸ میلی لیتر از بنزن را با ۲ میلی لیتر استونیتریل مخلوط کنید.
توجه – بنزن قابل اشتعال بوده و همین ماده ای سمی است. باید از استنشاق و تماس آن با پوست بدن جلوگیری شود.
۵-۵ حلال های ظهور
۶ میلی لیتر تولوئن را با ۳ میلی لیتر اتیل استات و ۱ میلی لیتر فورمیک اسید، مخلوط کنید.
۵-۵-۲ مخلوط کلروفرم – اتانول (۵+۹۵ )
۹۵ میلی لیتر کلروفرم را با ۵ میلی لیتر اتانول، مخلوط کنید.
۵-۶ محلول ۴۰ گرم در لیتر پتاسیم کلراید
۵-۷ محلول استات سرب
۲۰۰ گرم استات سرب را در یک بالون حجمی یک لیتری مدرج ریخته و به آن سه میلی لیتر استیک اسید اضافه کنید. سپس با آب مقطر به حجم رسانده و مخلوط نمایید.
۵-۸ معرف بنزیدین ۱
توجه – بنزیدین سرطان زا می باشد و بر اثر تنفس، تماس با پوست و خوردن ایجاد مسمومیت می کند.
۵-۸-۱ تهیه محلول بنزیدین با غلظت ۵ گرم بر لیتر
۵/۰ گرم بنزیدین را وزن کرده و به یک بالون ۱۰۰ میلی لیتری حاوی ۲۰ میلی لیتر آب و ۵/۱ میلی لیتر هیدرو کلریک اسید بریزید و با آب به حجم برسانید. محلول حاصل را در بطری شیشه ای تیره رنگ و دور از نور، نگهداری کنید.
۵-۸-۲ تهیه معرف
حجم های مساوی از محلول بنزیدین ( طبق بند ۵-۸-۱ ) و محلول نیتریت سدیم با غلظت ۱۰۰ گرم بر لیتر را تا دمای بین صفر درجه و منفی پنج درجه سلسیوس، سرد کنید.
محلول ها را کاملا مخلوط کرده تا به رنگ بنفش تیره و کدر درآید. سپس اجازه دهید تا دمای محلول به دمای اتاق برسد. در این حالت، رنگ محلول زرد شده و قابل استفاده است.
این محلول باید پیش از استفاده تهیه شود.
۵-۹ خاک دیاتومه ( Celite 545 ) شسته شده با هیدروکلریک اسید
۵-۱۰ نیتروژن
۵-۱۱ محلول استاندارد زیرالنون با غلظت ۱۰ میکروگرم در میلی لیتر، حل شده در بنزن.
بوسیله اسپکترومتر، طیف جذبی این محلول را در طول موج ۳۰۰ و ۳۲۰ نانومتر و با استفاده از سل های نوری سیلیکای ۱۰ میلی متری و بنزن، بعنوان شاهد اندازه گیری نمایید. بیشینه جذب A را که در حدود ۳۱۷ نانومتر است، ثبت کنید. با استفاده از فرمول ۱ به شرح زیر، غلظت زیرالنون در محلول را، بر حسب میکروگرم بر میلی لیتر محاسبه کنید:
فرمول (۱)

که در فرمول۱ ۳۱۸ ، جرم مولی زیرالنون ,۶۰۶۰ ضریب مولی۱, A بیشینه جذب وC غلظت
زیرالنون بر حسب میکروگرم بر میلی لیتر می باشد.
۶ وسایل لازم
وسایل معمول آزمایشگاهی و به ویژه وسایل زیر:

۶-۱ آسیاب، مناسب برای تهیه نمونه ای که به طور کامل از الک با قطر چشمه های یک میلی متری بگذرد.
۶-۲ شیکر، مناسب برای ایجاد ۱۰۰ حرکت نوسانی در دقیقه.
۶-۳ کاغذ صافی، درجه متوسط (در صورت استفاده از کاغذ صافی با عبور سریع، محلول کدر حاصل می شود و در صورت استفاده از کاغذ صافی با عبور کند، احتمال انسداد آن خواهد بود).
۶-۴ دستگاه تبخیر دوار با بالون ته گرد
۶-۵ وسایل کروماتوگرافی لایه نازک

یعنی: وسایل مورد نیاز برای تهیه پلیت (طبق بند ۶-۶) و لکه گذاری (پیپت های کپیلاری یا
سرنگ های میکرولیتری )، تانک ظهور و تجهیزات لازم برای اسپری معرف ( طبق بند ۵-۸ ) روی پلیت.
۶-۶ پلیت های کروماتوگرافی لایه نازک، با ابعاد ۲۰۰ × ۲۰۰ میلی متر بدون فلورسانس که به صورت تجاری موجود می باشند. در صورت نیاز می توان پلیت ها را به صورت زیر تهیه نمود ( مواد نوشته شده برای تهیه پنج پلیت کافی می باشند).
۳۰ گرم سیلیکاژل G-HR را در یک بالون مخروطی وزن کرده و به آن ۶۰ میلی لیتر آب اضافه کنید، در آن را بسته و به مدت زمان یک دقیقه بخوبی تکان دهید. سپس دوغاب حاصل را به گونه ای بروی پلیت ها پخش کنید، که لایه یکنواختی با قطر۲۵/۰ میلی متر حاصل شود. اجازه دهید تا در مجاورت هوا خشک شود، آنگاه آنها را در دسیکاتور نگهداری نمایید و صفحات را هنگام استفاده برای مدت زمان یکساعت در آون در دمای ۱۱۰ درجه سلسیوس فعال نمایید.
یادآوری- توصیه می شود از پلیت های تجاری استفاده شود.
۶-۷ لامپ UV با طول موج کوتاه ( طول موج ۲۵۳ نانومتر )
شدت تابش باید به گونه ای باشد، که در فاصله ۱۰۰ میلی متری لامپ از صفحه، بتوان لکه ۲۵ نانوگرمی زیرالنون را به روشنی تشخیص داد.
توجه – با توجه به خطرزایی نورUV برای چشم ها, باید در هنگام کار از محافظ برای چشم استفاده نمود.
۶-۸ لوله آزمایش, ۱۰ میلی لیتری با درپوش پلی اتیلنی.
۶-۹ فلورودانسیتومتر
۶-۱۰ حمام آب, قابل تنظیم در دمای ۶۰ درجه سلسیوس.
۶-۱۱ بالون حجمی, ۵۰۰ میلی لیتری با در سمباده ای.
۶-۱۲ قیف جداکننده, ۲۵۰ میلی لیتری.
۶-۱۳ استوانه مدرج , ۱۰۰ و ۲۵۰ میلی لیتری.
۶-۱۴ پی پت, ۵۰و۱۰۰ میلی لیتری.
۶-۱۵ سرنگ میکرولیتری.

۷ نمونه برداری
نمونه برداری بایست مطابق با استاندارد ملی ایران ;. انجام شود۱

۸ اساس روش
اساس کار این روش، عصاره گیری از آزمونه با مخلوطی از استونیتریل و محلول پتاسیم کلراید، صاف کردن، برداشتن حجم مشخصی از محلول و چربی زدایی با ایزواکتان و سپس خالص کردن درمخلوطی از استونیتریل،آب و استات سرب در حضور خاک دیاتومه می باشد.پس از صاف کردن

،
حجمی از محلول حاصل با کلروفرم استخراج شده و سپس تبخیر می گردد.
عصاره خشک حاصل از تبخیر، در مخلوطی از بنزن و استونیتریل حل شده و حجم مشخصی از آن برای کروماتوگرافی لایه نازک دو جهته۲به کار می رود. در نهایت مقدار زیرالنون با روش چشمی و یا به وسیله شدت سنجی نور فلورسانس نقاط زیر تابش نورUV ( ماورا بنفش ) در مقایسه با غلظت مشخص زیرالنون لکه گذاری شده بروی همان صفحه، اندازه گیری می شود.
تست تاییدی برای زیرالنون بوسیله معرف بنزیرین انجام می گیرد.

۹ روش اجرای آزمون
۹-۱ آماده سازی آزمایه
‌‌نمونه آزمایشگاهی باید به گونه ای آسیاب شود، که تمامی آن از الک با قطر چشمه یک میلی متر عبور نماید. سپس آن را کاملا مخلوط کرده و آزمایه را از آن تهیه کنید.
۹-۲ آزمونه
۵۰ گرم از آزمایه را با دقت ۰۱/۰ گرم در یک بالون حجمی ( طبق بند ۶-۱۱ )، وزن کنید.
۹-۳ استخراج
۱۸۰ میلی لیتر استونیتریل ( طبق بند ۵-۱ ) و۲۰ میلی لیتر از محلول پتاسیم کلراید (طبق بند ۵-۶ ) را بوسیله استوانه مدرج ( طبق بند ۶-۱۳ ) داخل بالون بریزید. سپس در بالون را بسته و آنرا به مدت زمان ۳۰ دقیقه به کمک شیکر ( طبق بند ۶- ۲ )، به هم بزنید. مخلوط را بر روی یک کاغذ
صافی ( طبق بند ۶-۳ )، صاف کنید.
بوسیله یک پیپت ( طبق بند ۶-۱۴ )، ۱۰۰ میلی لیتر از محلول صاف شده را به قیف جداکننده (طبق بند ۶-۱۲) بریزید و طی دو مرحله استخراج هر بار با۵۰ میلی لیتر ایزواکتان (طبق بند ۵-۲) ، چربی زدایی کنید.
فاز استونیتریل را در بالون ته گرد دستگاه تبخیر دوار ( طبق بند ۶-۴ )، جمع آوری نموده و سپس آن را تحت فشار پایین تا حد خشک شدن تبخیر کنید.
۹-۴ تخلیص
بوسیله یک استوانه مدرج ( طبق بند۶-۱۳)۲۰ میلی لیتر استونیتریل ( طبق بند ۵-۱ )، ۶۰ میلی لیتر آب و ۲۰ میلی لیتر محلول استات سرب ( طبق بند ۵-۷ ) را به باقیمانده تبخیر بیافزایید. سپس مخلوط را بهم زده و آنرا به مدت زمان ۱۰ دقیقه در حمام آب ( طبق بند ۶-۱۰ ) با دمای ۶۰ درجه سلسیوس قرار دهیدتا فازها جدا شوند. در این مرحله، رسوب تشکیل می گردد . ۵ گرم خاک دیاتومه ( طبق بند ۵-۹ ) به آن افزوده و سپس با استفاده از کاغذ صافی ( طبق بند ۶-۳ ) صاف کنید.
بوسیله یک پیپت ( طبق بند ۶-۱۴ ) ، ۵۰ میلی لیتر از محلول صاف شده را به یک قیف جداکننده
(طبق بند ۶-۱۲) بریزید و عمل استخراج را سه بار، هر بار با۵۰ میلی لیتر کلروفرم (طبق بند۵-۳)، انجام دهید. فاز کلروفرمی را از سولفات سدیم عبور دهید تا رطوبت زدایی شود. سپس آن را در بالون ته گرد دستگاه تبخیر دوار ( طبق بند ۶-۴ )، جمع آوری کرده و تحت فشار پایین تا حد خشک شدن تبخیر نمایید.
حاصل از تبخیر را با شستشو بوسیله کلروفرم به لوله آزمایش ( طبق بند ۶-۸ ) بریزید و در حمام آب ( طبق بند ۶-۱۰ )تحت جریان نیتروژن ( طبق بند ۵-۱۰ ) تا حد خشک شدن تبخیر کنید.
سپس ۵/۰ میلی لیتر از مخلوط بنزن استونیتریل ( طبق بند ۵-۴ ) را بوسیله سرنگ میکرولیتری با احتیاط به لوله افزوده و در آنرا محکم ببندید و خوب مخلوط نمایید.
۹-۵ کروماتوگرافی لایه نازک دو جهتی

۹-۵-۱ لکه گذاری محلول ها ( شکل ۱ )
روی پلیت ( طبق بند ۶-۶ ) دو خط مستقیم عمود بر هم رسم نموده، به گونه ای که ، هر کدام از این خطوط به ترتیب ۵۰ و ۶۰ میلی متر از کناره های پلیت فاصله داشته باشند. این خطوط جهت نشان دادن حد جابجایی حلال رسم می شوند. با استفاده از سرنگ میکرولیتری از عصاره نمونه و محلول های استاندارد مورد آزمون، مقادیر زیر را لکه گذاری نمایید:
– در نقطه A , 25 میکرولیتر از عصاره خالص شده ( طبق بند ۹-۴ ).
– در نقطه B , 10 میکرولیتر از محلول استاندارد ( طبق بند ۵-۱۱ ).
– در نقطه D , 10 میکرولیتر از محلول استاندارد ( طبق بند ۵-۱۱ ).
– در نقطه E , 15 میکرولیتر از محلول استاندارد ( طبق بند ۵-۱۱ ).
پلیت را با جریان هوا یا نیتروژن ( طبق بند ۵-۱۰ ) خشک کنید. لکه ها باید بیشینه دارای قطری برابر ۵ میلی متر باشد.

۹-۵-۲ ظهور ( به شکل ۱ توجه نمایید )
پلیت را در جهت با استفاده از حلال ظهور ( طبق بند ۵-۵-۱ ) ( ارتفاع حلال در تانک اشباع برابر ۱۰ میلی متر ) در محل تاریک ظاهر نمایید تا زمانیکه حلال تا خط نشانه برسد. پلیت را از تانک خارج کرده و به مدت زمان کمینه ۱۵ دقیقه در دمای معمولی در محل تاریکی قرار دهید تا خشک شود.
یادآوری – بهتر است که کروماتوگرام پس از ظهور در جهت ، در زیر نور ماوراء بنفش با طول موج ۲۵۳ نانومتر بررسی شده و لکه های زیرالنون با یک مداد علامت گذاری شوند ( لکه در نقطه B محل زیرالنون را نشان می دهد ).
سپس پلیت را در جهت با استفاده از حلال ظهور ( طبق بند ۵-۵-۲ ) ( ارتفاع حلال در تانک اشباع برابر ۱۰ میلی متر ) در محل تاریک ظاهر نمایید تا زمانیکه حلال تا خط نشانه بالا بیاید. پلیت را از تانک خارج نموده در محل تاریک در دمای معمولی قرار دهید تا خشک شود.

شکل ۱ – لکه گذاری محلولها و ظهور کروماتوگرام
۹-۶ روش تعیین میزان زیرالنون
برای تشخیص و تعیین میزان زیرالنون دو روش چشمی و فلورودانسیتومتری قابل اجرا می باشد، که در صورت وجود امکانات لازم روش دوم برتری دارد.
۹-۶-۱ روش اندازه گیری چشمی
در این روش، مقدار زیرالنون موجود در نمونه از طریق مقایسه شدت فلورسانس لکه های مربوط به عصاره و لکه های E,D,C ، استانداردها در زیر نور ماورا بنفش تعیین می گردد. پلیت باید در فاصله۱۰سانتی متری از لامپUV (طبق بند ۶-۷) قرار داده شود. ولی در صورت نیاز ( وصل کردن نقاط با رسم خط ) انجام گیرد.
اگر شدت فلورسانس عصاره ۲۵ میکرولیتری بیش از شدت فلورسانس محلول استاندارد ۱۵ میکرولیتری باشد, حجم کمتری را در نقطهA لکه گذاری کنیدو یا عصاره مورد آزمون را با استفاده از مخلوط بنزن – استونیتریل ( طبق بند ۵-۴ ) رقیق نموده و مجددا عملیات کروماتوگرافی لایه نازک را تکرار کنید.
۹-۶-۲ روش اندازه گیری با فلورودانسیتومتر
شدت فلورسانس لکه ها را با استفاده از دستگاه فلورودانسیتومتر ( طبق بند ۶-۹ ) در ,به طور مثال: طول موج تهییج ۳۱۳ نانومتر و طول موج نشر ۴۴۳ نانومتر (بیشینه نشر ۴۷۰ نان

ومتر)، اندازه گیری کنید.
مقدار زیرالنون در لکه عصاره مورد آزمون از طریق مقایسه شدت فلورسانس آن با لکه های E,D,Cمحلول استاندارد، تعیین می شود.
۹-۷ آزمون تاییدی برای زیرالنون
پلیت ظاهر شده در بند ۹-۵ را با معرف بنزیدین ( طبق بند ۵-۸ )، اسپری نمایید. در صورت وجود زیرالنون, لکه های قرمز آجری روشن در دمای اتاق ایجاد شده که پس از قرار گرفتن در برابر هوا بمدت زمان کمینه ۱۵ دقیقه, رنگ آن محو می شود.

۱۰ بیان نتایج
۱۰-۱ اندازه گیری چشمی
مقدار زیرالنون, بر حسب میکروگرم در کیلوگرم محصول، با استفاده از فرمول۲ به شرح زیر به دست می آید:
فرمول (۲)

در فرمول۲ :
: غلظت زیرالنون در محلول استاندارد ( طبق بند ۵-۱۱ )، بر حسب میکروگرم در میلی لیتر.
: جرم آزمونه بسته به حجم عصاره خالص شده، بر حسب گرم.
: حجم نهایی عصاره با توجه به میزان رقیق سازی, بر حسب میکرولیتر.
: به ترتیب حجم لکه عصاره و حجم لکه محلول استاندارد زیرالنون که شدت های نور فلورسانس مشابه دارند, بر حسب میکرولیتر.
۱۰-۲ اندازه گیری فلورودانسیتومتری
غلظت های ۱۰۰۰، ۴۰۰۰، ۱۰۰۰۰، ۲۰۰۰۰ و۴۰۰۰۰ نانوگرم بر میلی لیتر از استاندارد زیرالنون را با در نظر گرفتن کلیه شرایط لکه گذاری و ظهور بر روی صفحه کروماتوگرافی لکه گذاری نموده و صفحه را ظاهر کنید. منحنی کالیبراسیون را به طوری که روی محور Y تغییرات مربوط به غلظت استاندارد زیرالنون بر حسب نانوگرم و محور X تغییرات مربوط به علامت پیک باشد، رسم نمایید. جرم زیرالنون در نمونه با استفاده از معادله محاسبه می گردد که در آن a شیب خط منحنی کالیبراسیون و bعرض از مبدا می باشد. مقدارزیرالنون بر حسب میکروگرم در کیلوگرم محصول، با استفاده از فرمول۳ به شرح زیر به دست می آید:
فرمول (۳)

در فرمول۳ :
: جرم آزمونه که متناسب با حجم عصاره خالص شده باشد، بر حسب گرم ( ۵/۱۲ گرم ).
: جرم زیرالنون در لکه عصاره ( با توجه به حجم ) به دست آمده از اندازه گیری, برحسب نانوگرم.
: حجم نهایی عصاره با توجه به میزان رقیق سازی, بر حسب میکرولیتر.
: حجم عصاره لکه گذاری شده روی پلیت, بر حسب میکرولیتر ( ۲۵ میکرولیتر ).

۱۱ دقت

نتایج آماری حاصل از آزمون های بین آزمایشگاهی که در تعداد ۲۰ آزمایشگاه انجام گرفته، در جدول۱ نشان داده شده است. لازم به یادآوری است، که هر آزمایشگاه سه آزمون مطابق با استاندارد بین المللی ایزو ۵۷۲۵ سال ۱۹۹۴، انجام داده است( ۲ )، همچنین ۱۶ مورد از نتایج برای ذرت B کاربرد دارند.

جدول ۱ – نتایج بر حسب میکروگرم در کیلوگرم
نمونه ذرت A B
( نمونه A که تا سه بار رقیق شده است )

تعداد آزمایشگاه های باقیمانده پس از حذف نتایج مشکوک. ۲۰ ۱۵
میانگین. ۷۳۴ ۲۱۹
انحراف معیار استاندارد برای تکرارپذیری, .
ضریب تغییر تکرارپذیری.
تکرارپذیری, ۸۳/۲
۷۸
۱۱%
۲۲۱ ۳۴
۱۵%
۹۶

انحراف معیار استاندارد برای تجدیدپذیری, .
ضریب تغییر برای تجدیدپذیری.
تکثیرپذیری, ۸۳/۲
۲۸۲
۳۸%
۷۹۸ ۱۲۵
۵۷%
۳۵۴

۱۲ گزارش آزمون
گزارش آزمون باید دارای آگاهی های زیر باشد:
۱۲-۱ روش آزمون طبق استاندارد ملی ایران ;;;. .
شرح نتایج به دست آمده.

علاوه بر نتایج به دست آمده، باید تمامی جزئیات عملی که در استاندارد ملی ایران ;;. بیان نشده و یا اختیاری تلقی شده است، همراه با جزئیات هر رخدادی که ممکن است تاثیری بر نتایج آزمون داشته باشد نوشته شود.
گزارش آزمون، باید شامل تمامی جزئیات لازم برای شناسایی کامل نمونه باشد.
تاریخ انجام آزمون.
نام و نام خانوادگی و امضا آزمایش کننده.