تحقیق بررسی تکوین یک روش گاز کروماتوگرافی برای تعیین مقدار آمانتادین در مایعات بیولوژیک

توجه : به همراه فایل word این محصول فایل پاورپوینت (PowerPoint) و اسلاید های آن به صورت هدیه ارائه خواهد شد

 تحقیق بررسی تکوین یک روش گاز کروماتوگرافی برای تعیین مقدار آمانتادین در مایعات بیولوژیک دارای ۶۶ صفحه می باشد و دارای تنظیمات در microsoft word می باشد و آماده پرینت یا چاپ است

فایل ورد تحقیق بررسی تکوین یک روش گاز کروماتوگرافی برای تعیین مقدار آمانتادین در مایعات بیولوژیک  کاملا فرمت بندی و تنظیم شده در استاندارد دانشگاه  و مراکز دولتی می باشد.

این پروژه توسط مرکز تحقیق بررسی تکوین یک روش گاز کروماتوگرافی برای تعیین مقدار آمانتادین در مایعات بیولوژیک۲ ارائه میگردد

توجه : در صورت  مشاهده  بهم ریختگی احتمالی در متون زیر ،دلیل ان کپی کردن این مطالب از داخل فایل ورد می باشد و در فایل اصلی تحقیق بررسی تکوین یک روش گاز کروماتوگرافی برای تعیین مقدار آمانتادین در مایعات بیولوژیک،به هیچ وجه بهم ریختگی وجود ندارد

---

بخشی از متن تحقیق بررسی تکوین یک روش گاز کروماتوگرافی برای تعیین مقدار آمانتادین در مایعات بیولوژیک :

تحقیق بررسی تکوین یک روش گاز کروماتوگرافی برای تعیین مقدار آمانتادین در مایعات بیولوژیک در ۶۰ صفحه ورد قابل ویرایش

چکیده

در این تحقیق یک روش ساده و کم هزینه به منظور تعیین مقدار آمانتادین در سرم با استفاده از دستگاه گاز کروماتوگراف طراحی گردید.

در این روش از گاز حامل نیتروژن ، ستون OV17 و دتکتور FID به همراه استاندارد داخلی پسودوافدرین استفاده شد. نمونه ها توسط اسید پرکلریک پروتئین زدایی شده و عمل استخراج توسط اتر انجام گردید که بازیافت روش کامل بود.

در شرایط مذکور پیک آمانتادین ،‌استاندارد داخلی از یکدیگر و مواد آندوژن به خوبی جدا گردید. ضریب تغییرات درون روزی و بین روزی روش آنالیز در حد قابل قبول بوده و حد آشکارسازی روش ۸/۰ محاسبه شد.

واژه های کلیدی: آمانتادین ،‌ساس ،‌پلاسما

پیشگفتار

آمانتادین دارویی ضد ویروسی است که دارای خواص آنتی پارکینسونی است

بیماری پارکینسون چهارمین بیماری شایع نورودژنراتیو در افراد مسن است . که ۱% افراد بالای ۶۵ سال و ۴/۰% افراد بالای ۴۰ سال را تحت تأثیر قرار می‌دهد . سن متوسط شروع حدود ۵۷ سال است . ( ۱ )
ایتولوژی و پاتوفیزیولوژی :

در پارکینسون اولیه ، نورونهای جسم سیاه و ساقه مغز از دست می‌ روند که دلیل آن شناخته نشده است . از دست رفتن این نورنها باعث کاهش نوروترنسمی‌تر دو پامین در این مناطق می‌ شود . شروع معمولاً بعد از ۴۰ سال است .

پارکینسونسیم ثانویه ، در اثر بیماریهای ایدیوپاتیک دژنراتیو ، داروها ، یا توکسین ها ایجاد می‌ شود . شایع ترین دلیل پارکینسونیسم ثانویه مصرف داروهای آنتی سایکوتیک و رزرپین است که بوسیله بلوک رسپتورهای دو پامین باعث پارکینسون می‌ شوند . دلایل دیگر عبارتند از مونواکسید کربن مسمومی‌ت با منگنز ، هیدروسفالوس ، تومورها و انفارکت هایی که مغز می‌انی را تحت تأثیر قرار می‌ دهند . ( ۱ )

داروهایی که سبب ایجاد سندرم پارکینسونیسم می‌ شوند یا آنتاگونیست رپستورد و دوپامین هستند ( مثل داروهای آنتی سایکوتیک ) ، یا سبب تخریب نورونهای دوپا منیرژیک در نیگرو استر یا تال می‌ شوند . ( مثل MPTP ) ( 2 )
علائم و نشانه های بالینی :

در ۵۰ تا ۸۰ درصد بیماران ، بیماری بی سرو صدا و غافلگیرانه با ۴ تا ۸ HZ ترمور ( Pill – rolling ) یک دست شروع می‌ شود . ترمور و لرزش در حال استراحت بیشترین مقدار است و در حال حرکت کمتر می‌ شود . و در هنگام خواب ناپدپد می‌ شود . و با فشارهای روحی و خستگی بیشتر می‌ شود . معمولاً دست ها و بازوها و پاها بیشتر تحت تأثیر قرار می‌ گیرند . و به همین ترتیب فک ، زبان ، پلک هم می‌ توانند تحت تأثیر قرار بگیرند . اما صدا لرزش پیدا نمی‌ کند . در خیلی از بیماران فقط ریجیدیتی رخ می‌ دهد . و لرزش وجود ندارد . سفتی پیشرفت می‌ کند و حرکات کند می‌ شود . ( برادی کاردی ) یا کم می‌ شوند ( هیپوکینزیا ) و یا شروع حرکات سخت می‌ شود ( آکینزیا ) .

که سختی و هیپوکینزی ممکن است منجر به درد و احساس خستگی شوند . صورت شبیه ماسک می‌ شود . با دهان باز و ناپدپد شدن برق چشم ها که ممکن است بادپرسیون اشتباه شود . راه رفتن مشکل می‌ شود . فرد به این سو و آن سو حرکت می‌ کند و خودش را می‌ کشد . قدم ها کوتاه و بازوها در کنار کمر ثابت اند و حرکت نمی‌ کنند. ( ۱ )
درمان

بیماری پارکینسون معمولاً پیشرونده است و منجر به ناتوانی فزاینده می‌ شود مگر اینکه درمان موثر انجام گیرد . غلظت دوپامین که بطور طبیعی در هسته های قاعده ای مغز بالا می‌ باشد در پارکینسونیسم کاهش می‌ یابد . تلاش های دارویی برای تقویت فعالیت دوپامینرژیک با آگوسیت های دوپامین توفیقاتی در تخفیف تعداد زیادی از علایم کلینیکی این عارضه داشته است . یک رویکرد دیگر که مکمل روش قبل است عبارتی از ایجاد تعادل طبیعی بین تأثیرات کولینرژیک و دوپامینرژیک روی هسته های قاعده ای توسط داروهای آنتی موسکارینی می‌ باشد . ( ۲ )
۲ ـ ۱ ـ فارماکوکینتیک :

جذب : به راحتی و اغلب به طور کامل از دستگاه گوارش جذب می‌ شود . یک دوز mg100 خوراکی آن سطح سرمی‌ در مدت ۸ ـ ۱ ساعت ایجاد می‌ کند( ۶ ) اوج غلظت پلاسمایی ۴ ساعت بعد از‌مصرف ایجاد می‌ شود. (۴ و۵)

حداکثر غلظت بافتی هنگامی‌ که دوز mg100 هر ۱۲ ساعت مصرف شود در مدت ۴۸ ساعت ایجاد می‌ شود ( ۶ )
انتشار :

بعد از مصرف خوراکی آمانتادین در بافتهایی مانند قلب و کلیه و کبد و شش ها یافت شده است . از جفت و سد خونی ـ‌‌ مغزی عبور می‌ کند و همچنین به شیر ترشح می‌ شود . پروتئین با یندینگ آن در حدود ۶۷% است . ( ۴ )
دفع :

بیشتر دارو به صورت دست نخورده از طریق فیلتراسیون گلومرولی دفع می‌ شود . هر چند متابولیت استیله هم در ادرار ردیابی شده است . (‌4 )

در حدود ۵۶% دوز به صورت دست نخورده در مدت ۲۴ ساعت در ادرار وارد می‌ شود و در حدود ۸۶% آن در طی ۴ روز وارد ادرار می‌ شود . ( ۶ )‌
۳ ـ ۱ فارماکولوژی

مکانیسم دقیق آن شناخته نشده است اما تصور می‌ شود باعث ریلیز دو پامین از انتهای دو پامینرژیک اعصابی می‌ شود که در جسم سیاه افراد پارکینسونی باقی مانده اند . ( ۷ ) در بیماری انفلوانزا ، آمانتادین از نفوذ ذرات RNA ویروس به سلول می‌زبان جلوگیری می‌ کند . همچنین از نسخه برداری ویروس جلوگیری می‌ نماید ( ۶ )
۴ ـ ۱ عوارض جانبی

عوارض معمولاً وابسته به دوز هستند و نسبتاً خفیف می‌ باشند. غلظت های پلاسمایی بالا از آمانتادین ( ۱ تا ۵ میکروگرم در میلی لیتر) با پاسخ های نورتوکسیک جدی همراه است شامل : تحریک پذیری ، اشکال در تمرکز ، سرگیجه ،‌ گیجی ، بی خوابی ، سردرد تغییرات خلق یا واکنش های سایکوتیک ، توهمات، هذیان ، تشنج یا کوما و آریتمی‌‌های قلبی ( ۳ )

اثرات نوروتوکسیک آمانتادین با مصرف همزمان آنتی هیستامین ها ، داروهای سایکوتروپیک و آنتی کولینرژیک ها مخصوصاً در افراد مسن تر افزایش می‌ یابد . ( ۳ )

سایر عوارض آمانتادین شامل هیپوتانسیون ارتواستاتیک ، ادم محیطی ، آتاکسی ، لتارژی، تهوع و استفراغ ، بی اشتهایی ، خشکی دهان ، یبوست ، راش پوستی ، تاری دید ، حساسیت به نور ، لکوپنی و CHF .
۵ ـ ۱ تداخل دارویی

ممکن است اثرات آنتی کولینرژیک ها را تشدید کند ( ۴ )

داروهایی که PH ادرار را بالا می‌ برند ممکن است ترشح آمانتادین در ادرار را کم کنند.(۴ )‌
۶ ـ ۱ شکل دارویی و مورد مصرف

آمانتادین با نام های تجاری Mantadix , Antadine , symmetrel , symadine , Virofral در اشکال کپسول ۱۰۰M و شربت در بازار دارویی دنیا وجود دارد ( ۱ و ۵ )

آمانتادین یک آگونیست ضعیف دو پامین و دارای خواص آنتی موسکارینی است . همچنین آنتاگونیست رسپتورهای N ـ متیل ـ D ـ آسپارتات می‌ باشد . آمانتادین دارای خواص آنتی پارکینسونی است و در درمان مخصوصاً در مراحل اولیه بیماری بکار می‌ رود . در بهبود علائمی‌ مانند برادی کینزی ـ سفتی و لرزش مفید است . اما ممکن است کم کم نسبت به آن مقاومت ایجاد شود ( ۴)

در درمان پارکینسون معمولاً با دوز mg100 در روز شروع می‌ شود و تا دوز ۱۰۰ mg دوبار در روز افزایش می‌ یابد . گاهی هم تا دوز mg 400 در روز استفاده می‌ شود . اما این دوز نباید بیشتر شود . ( ۴ )

در افراد بالای ۶۵ سال به دلیل کاهش کلیرانس کلیوی در این گروه سنی باید حداقل دوز موثر استفاده شود . ( ۴ )‌
۱ ـ ۳ ـ ۲ گاز حامل

یک استوانه گاز با فشار زیاد به عنوان منبع گاز حامل به کار برده می‌ شود . در کار با GC در دمای ثابت ، نفوذ پذیری ستون در طول مدت تجزیه تغییر نمی‌ کند . برای آنکه فشار یکنواختی به ابتدای ستوان وارد شود و در نتیجه سرعت جریان گاز ثابت بماند ، باید از یک تنظیم کننده فشار استفاده شود . در یک دمای معین این سرعت جریان ثابت گاز ، اجزای موجود در نمونه را در مدت معینی ( زمان بازداری ) از ستون می‌‌شوید.(۱۱)

گازهایی که معمولاً مورد استفاده قرار می‌ گیرند عبارتند از هیدروژن ، هلیم و نیتروژن .

گاز حامل باید دارای خصوصیات زیر باشد :

۱ ـ بی اثر باشد تا از هر گونه تأثیر بر نمونه یا حلال اجتناب شود .

۲ ـ قادر باشد که نفوذ گاز را به کمترین مقدار برساند .

۳ ـ به طور خالص و همی‌شه در دسترس باشد .

۴ ـ ارزان باشد .

۵ ـ برای آشکار ساز مورد نظر مناسب باشد . (‌11 )
۲ ـ ۳ ـ ۲ محل تزریق نمونه

نمونه از طریق محل تزریق ( inyector ) وارد گاز کروماتوگرافی می‌ شود . این محل محفظه ای کوچک است که یک طرف آن بوسیله پرده ای ( Septun ) لاستیکی یا سیلیکونی پوشیده شده است . نمونه های مایع بوسیله یک ریز سرنگ مدرج که ظرفیت آن چند میکرولیتر است از طریق پرده لاستیکی به داخل محفظه تزریق می‌ شوند . سرنگ محتوی نمونه ، پرده را سوراخ کرده وارد محفظه می‌ شود و پس از انجام تزریق و خروج سوزن ، پرده به حالت اول باز می‌ گردد و سوراخی روی آن باقی نمی‌ ماند . درمای محفظه ورودی نمونه معمولاً ۵۰ بیشتر از نقطه جوش کم فرارترین جزء سازنده‌ نمونه است و بنابراین تبخیر آنی صورت می‌ گیرد . ( ۱۱ و ۱۰ )

برای جلوگیری از پهن شدن نوار ، نمونه باید کوچک باشد و به سرعت و به صورت یک « توپی » بخار وارد ستون شود . ( ۱۱ و ۱۰ )

برای ستونهای تجزیه ای معمولی ، اندازه نمونه از چند دهم یک میکرولیتر تا ۲۰ تغییر می‌ کند .

در مورد ستونهای مویین چون قطر ستون بسیار کم است باید از مقادیر بسیار کم نمونه استفاده شود تاپیکهای تیز بدست آید برای این منظور یک شکافنده نمونه بکار گرفته می‌‌شود تا تنها کسر کوچکی از نمونه تزریق شده را به سر ستون حمل کند (۱۰) این روش را Head – space آنالیز گویند.
۳ ـ ۳ ـ ۲ ستون ها

جداسازی اجزای نمونه در داخل ستون هایی که از فاز ساکن پر شده اند انجام می‌ شود چنانچه فاز ساکن جامد باشد آن را کروماتوگرافی گاز ـ جامد ( G S C ) می‌ نامند و اگر فاز ساکن مایع باشد آن را کروماتوگرافی گاز ـ مایع ( G L C ) می‌ نامی‌م . مایع فاز ساکن به صورت لایه نازکی بر روی جسم جامد بی اثری پخش می‌ شود . ( ۱۱ )

برای اینکه مواد موجود در ستون ، به طور یکنواخت پر شود ستون مستقیم را ابتدا پر می‌ کنند و برای اینکه درآون قرار گیرند به صورت مارپیچ در می‌ آورند .

ستون ها به دو دسته تقسیم می‌ شوند .
الف ـ ستون های پر شده ( Packed Columu ) :

ستونهای پر شده امروزی از لوله های شیشه ای ، فلزی ( فولاد زنگ نزن ، مس، آلومینیم )‌یا تفلون ساخته می‌ شوند که نوعاً طول ۲ تا ۳ متر و قطر داخلی mm 4 ـ ۲ دارند ( ۱۰ ) .

قطر خارجی ستونهای تجزیه ای استاندارد اینچ است . (‌11 )

برای پرکردن ستون ، ، ابتدا باید فاز ساکن را که یک مایع غلیظ است به صورت لایه ای روی یک جسم جامد بی اثر به نام جامد نگهدارنده کشید . برخی از خصوصیات یک جامد نگهدارنده خوب عبارتند از :

۱ ـ بی اثر بودن ( جذب سطحی بر روی آن انجام نشود . )

۲ ـ مقاوم در برابر خرد شدن

۳ ـ مساحت سطح زیاد

۴ ـ شکل منظم و اندازه یکنواخت ( ۱۱ )

ماده ‌خام اکثر ترکیباتی که به عنوان نگهدارنده جامد در کروماتوگرافی گازی مورد استفاده قرار می‌ گیرند دیاتومه است . خاک دیاتومه سیلیکای هیدراته طبیعی است که اسکلت دیاتومه ها را تشکیل می‌ دهد . سیلیکای طبیعی دارای تعداد زیادی گروههای OH است که می‌ تواند باعث جذب سطحی فیزیکی گونه های آنالیت قطبش پذیر یا قطبی مانند الکل ها یا هیدورکربنهای آروماتیک روی سطوح تکیه گاه شود . این جذب سطحی منجر به پهن شدن و اغلب دنباله دارد شدن پیکها می‌ شود . برای رفع این مشکل مواد تکیه گاه می‌ توانند توسط سیلان دارد شدن با دی متیل کلرو سیلان ( DMCS ) غیر فعال شوند .

۷ ـ ۱ ـ ۳ الکتروشیمی‌

اکسیداسیون آمانتادین در تری فلوئرواستیک اسید موجهای آندیک متعددی می‌ دهد . اطلاعات ولتامتری عبارتند از : و (۱۳)

همچنین برای تعیین مقدار آمانتادین از روشهای کولومتری نیز استفاده شده است . ( ۱۳)
۸ ـ ۱ ـ ۳ فلورسانس اسپکترومتری

واکنش با Fluores camine در غلظت ۱ میکرومول ، بعد از استخراج در ۵ = pH با اتیل استات محصولی با ماکزیممی‌ در ۴۷۵/ ۳۹۵ نانومتر می‌ دهد .

حد قابل تشخیص ۱ میکروگرم در میلی لیتر است . ( ۱۳ )
۲ ـ ۳ بازنگری مقالات آنالیز پلاسمایی آمانتادین هیدروکلراید

۱ ـ در سال ۱۹۹۰، Hiroyuki Fujino و Shujiro GoyaA روشی را برای اندازه گیری آمانتادین به وسیله دستگاه HPLC ارائه دادند . در این روش آمانتادین به وسیله واکنشگر۳ – ( 4,6- Difluorotriazinyl ) amino-7-methoxy coumarin در بنزن در دمای ۱۴۰ به مدت ۵ دقیقه به مشتق فلورسانس دارد تبدیل شد . و به وسیله دتکتور فلورسانس تعیین مقدار شد . حد تشخیص در این روش fmal250 در ۱۰۰ میکرولیتر ادرار بود . ( ۱۴ )‌

۲ ـ در سال ۱۹۹۰ DAVID C . LOCKE , JOHN , T . SCHMERMUND روشی را برای اندازه گیری آمانتادین با دتکتور فوتویونیزان ( photoionization ) دستگاه HPLC ارائه دادند . در این مطالعه از سیستم فاز معکوس و فاز متحرک آب ـ متانول ـ تری اتیل آمین ارتوفسفریک اسید استفاده شد . – حد تشخیص ۲۵ng در هر تزریق بود.( ۱۵ )

۳ ـ در سال ۱۹۹۰ J.TEEUWSEN , F.A.L VAN DERHORST و همکاران روشی را برای اندازه گیری آمانتادین در ادرار با استفاده از روش HPLC ارائه کردند . در این روش میسل های کاتیونی برای مشتق سازی آمانتادین با کروموفور۱-fluoro-2,4-dinitrobenzene در ادرار استفاده شد . در حضور mM90 ستیل تری متیل آمونیوم بروماید واکنش تبدیل آمانتادین به مشتق آن در مدت ۴ دقیقه در دمای ۶۰ و ۱ = pH کامل شد . از سیستم فاز معکوس HPLC استفاده شد و حد تشخیص در این روش ۷۵ بود . ( ۱۶ )

۴ ـ در سال ۱۹۹۳ Ira S.Krull , Feng-Xiang Zhou در آمریکا روشی را برای اندازه گیری آمانتادین در پلاسما و ادرار بوسیله automated solid phase derivatization ارائه کردند . در این روش مشتق سازی و استخراج همزمان مایعات بیولوژیک بوسیله ۹-Fluoreneacetate واکنشگرمشتق ساز فاز جامد انجام شد.

مشتق آمانتادین در سیستم فاز معکوس جداسازی و بوسیله دتکتور فلورسانس اندازه گیری شد . حساسیت روش آنها برای اندازه گیری آمانتادین در ادرار و پلاسما ۷۴/۰ و ۷۹/۰ نانوگرم بود . ( حجم تزریق ۵۰ میکرولیتر ) ( ۱۷ )

۵ ـ در سال ۱۹۸۰ Noall MW , Stumph mj و Knight V. روشی را برای اندازه گیری آمانتادین در ادرار به وسیله دستگاه گاز کروماتوگراف ارائه دادند . در این روش از بتا ـ فنیل اتیل آمین به عنوان استاندارد استفاده شد . نمونه های ادراری قلیایی شده و با ۵/۰ میلی لیتر کلروفرم استخراج شدند . فاز آلی جدا شده و مستقیماً به دستگاه گاز کروماتوگرافی تزریق شدند . پاسخ خطی در محدوده ۲ تا ۱۲۵ میلی گرم در میلی لیتر مشاهده شد . حد قابل تشخیص ۵/۰ بود . ( ۱۸ )

در این مطالعه حساسیت روش بسیار پائین است و در واقع برای اندازه گیری آمانتادین در پلاسما حساسیت ندارد . از طرفی در این روش از ۲ ـ فنیل اتیل آمین به عنوان استاندارد داخلی استفاده شده است که یک ماده اندوژن می‌ باشد و در ادرار به مقدار قابل توجه ترشح می‌ شود .
۲ ـ ۳ ـ ۳ ـ انتخاب استاندارد داخلی

سیکلوهگزیل آمین ، نقتیل آمین ، ایمی‌ پرامین و پسودوافدرین آزمایش شدند که با توجه به زمان بازداری و عدم تداخل با مواد آندوژن پسودوافدرین به عنوان مناسب ترین استاندارد داخلی انتخاب گشت.
۳ – 3 ـ ۳ ـ حلال استخراجی

حلالهای کلروفرم ، هگزان و دی اتیل اتر مورد بررسی قرار گرفتند . که با توجه به میزان بازیافت و نیز انتخاب پذیری بهترین نتایج با دی اتیل اتر بدست آمد .
۴ ـ ۳ ـ ۳ ـ آماده سازی نمونه های سرمی‌

۱-۴-۳-۳- خصوصیات خون و انواع روشهای استخراج

با توجه به اهمیت بسیار بالای استخراج دارو از مایعات زیستی (خون، پلاسما یا سرم و ادرار) ، لذا ابتدا مختصری راجع به این مایع زیستی (خون) و انواع روشهای استخراج توضیح داده می شود و یک مقایسه نسبی نیز بین این روشها و مزایا و معایب آنها نسبت به هم ارائه می گردد.

خون پیچیده ترین مایع زیستی است که پس از دریافت از انسان و یا حیوان به صورت مایعی شفاف و بافر شده محتوی پروتئین های محلول، چربیها و نمک های محلول در آب و سلول های معلق می باشد. خوشبختانه جزء اصلی خون یعنی گلبولهای قرمز یا ارپترویست ها به سادگی از محلول شفاف یا پلاسما توسط سانتریفوژ کردن قابل جداسازی است، معهذا در صورت عدم دقت در عملکرد با خون سلولها می توانند شکسته شده و روش عملی جداسازی بسیار پیچیده گردد.

به طور کلی هیچگاه خون به طور مستقیم استخراج نشده، بلکه ابتدا همیشه سرم یا پلاسما تهیه و سپس بقیه عملیات بر روی آنها صورت می پذیرد، در صورتیکه مستقیم از خون صورت پذیرد باید تدابیر لازم جهت اجتناب از پارگی سلولهای قرمز اتخاذ گردد.