دانش رسان |
مرکز علم و دانش کشور مقدمه‌ای بر بیوتکنولوژی انتقال ژن در ماهی
در حال بارگذاری
توجه : به همراه فایل word این محصول فایل پاورپوینت (PowerPoint) و اسلاید های آن به صورت هدیه ارائه خواهد شد
مقدمه‌ای بر بیوتکنولوژی انتقال ژن در ماهی دارای ۵۵ صفحه می باشد و دارای تنظیمات در microsoft word می باشد و آماده پرینت یا چاپ است
فایل ورد مقدمه‌ای بر بیوتکنولوژی انتقال ژن در ماهی کاملا فرمت بندی و تنظیم شده در استاندارد دانشگاه و مراکز دولتی می باشد.
این پروژه توسط مرکز مقدمه‌ای بر بیوتکنولوژی انتقال ژن در ماهی۲ ارائه میگردد
توجه : در صورت مشاهده بهم ریختگی احتمالی در متون زیر ،دلیل ان کپی کردن این مطالب از داخل فایل ورد می باشد و در فایل اصلی مقدمه‌ای بر بیوتکنولوژی انتقال ژن در ماهی،به هیچ وجه بهم ریختگی وجود ندارد
بخشی از متن مقدمه‌ای بر بیوتکنولوژی انتقال ژن در ماهی :
مقدمه‌ای بر بیوتکنولوژی انتقال ژن در ماهی
بخش اول: دست کاریهای ژنی در ماهیان
مقدمه:
یکی از زمینه های که امروزه بیوتکنولوژیست ها روی آن تحقیق می کنند ایجاد گونه های ترانسژنیک است. طبق تعریف ترانسژنیک موجودی است که، دارای DNA نو ترکیبی باشد. به طوری که در ژنوم آن موجود ژن نو ترکیب بیان می شود. بیان ژن خارجی یکی از جنبه های تولید ترانسژنیک و انتقال DNA به زاده های هدف بعدی می باشد. در این زمینه تکنیک میکرواینجکش در انتقال ژن به تخم مهره داران اولین بار به وسیله گوردون (Gordon) و همکاران در سال ۱۹۸۰ گزارش شد. در این تکنیک یک لوله مؤئین شیشه ای را برای وارد کردن DNA نو ترکیب به پیش هسته نریا با سیتوپلاسم تخم لقاح یافته موش به کار گرفتند. در همین سال میکروانجکش مستقیم DNA نو ترکیب در شرایط آزمایشگاهی جهت ایجاد حیوانات ترانسژنیک مورد استفاده قرار گرفته است. طوری که ژن را از این طریق وارد تخم های لقاح نیافته یا لقاح یافته موجوداتی نظیر جنین توتیای دریایی، موش، قورباغه، مگس سرکه، خرگوش و خوک کرده اند (Brem 1988) در سال ۱۹۸۵ زئو (Zhu) و همکاران ژنی شامل پرتومتالوتیونین موش و ژن هورمون رشد انسانی را به ناحیه مرکزی صفحه زایای تخم های لقاح یافته ماهی طلایی تزریق کردند و قسمتی از این ژن را در DNA ماهیان مشاهده کرند. در همین سال روکونس (Rokkones) تکنیک میکرواینجکشن دو مرحله ای بر روی تخم آزاد ماهیان را شرح داده است. در این تکنیک ابتدا به کمک یک وسیله نوک تیز فلزی در قطب حیوانی سوراخی ایجاد شده و از طریق این سوراخ محلول حاوی DNA نو ترکیب به کمک پی پت ریز تخم شدند به طوری که به کیسه زرده وارد نشوند. پس از ۱۴ روز پلاسمیدهای کامل را مشخص کردند. چوروت (Chourrout) و همکاران در سال ۱۹۸۶ روش فوق را بر روی قزل آلای قهوه ای رنگ به کار برند با توجه به وجود DNA خارجی همراه با ملکولهای DNA میزبان پیشنهاد شده که این ژن به داخل ژنوم ماهی وارد شده است. محققان به ورش دستی یا از طریق هضم آنزیمی از جمله با تریپسن کوریون را برداشته و تزریق میکرواینجکشن انجام دادند. در همین سال اوزاتا (Ozata) ماهی کوچک مدوکا را به عنوان مدلی برای ترانسژنیک مطرح کرد. او پلاسمیدهای حاوی ژن کریستالین جوجه را به هسته تخم ها از طریق میکرواینجکشن وارد کرد. به علت کوریون سفت در تخم لقاح یافته تعدادی از ماهیان استفاده از میکرواینجکشن مشکل و مستلزم اتلاف وقت زیادی است. به همین منظور روشهایی جهت غلبه بر این مشکل به کار گرفته شده است. از جمله در سال ۱۹۸۸ بریم (Brem) و همکاران ژن هورمون رشد انسان را به کمک وکتور مناسب از طریق میکروپیل به صفحه زایای تخم های تیلاپیا تزریق کردند و رشد بچه ماهیان طی ۹۰ روز بررسی شد. مشابه این تحقیق توسط فلت چر (Fletcher) و همکاران در همین سال بر روی ماهی آزاد اتلانتیک انجام شد. همچنین تکنیکهای دیگر شامل الکتروپورشن (Electroporation) شلیک ذرات ژن Shatagun بر روی تخمک و طراحی لیپوزوم جهت ورود به زرده تخم انجام شده است. میکر واینجکشن نیاز به مهارت زیادی دارد و از طرفی سرعت آن کم و هزینه و تجهیزات آن زیاد است و مستلزم زحمات و زمان زیادی برای ایجاد تعداد زیادی از ما هیان ترانسژنیک است علاوه بر این از دیگر مشکلات آن این است که در تخم های القاح یافته اغلب ماهیان هسته به وسیله میکرسکوپ قابل روئیت نیست بنابراین DNA را به سیتو پلاسم تزریق می کنند.
۲-۱- بیان ژن هورمون رشد ماهی در باکتریچ
هورمون رشد یک پلی پپتید تک زنجیره است که به وسیله هیپوفیز پیشین تولید و ترشح می شود. در مهره داران اولین نقش هورمون رشد افزایش رشد سوماتیکی است علاوه بر این ماهیان استخوانی این هورمون در تنظیم شرایط اسمزی و تعادل الکترولیتی بدن و چندین عمل متابولیکی دیگر نقش دارد. ساختار ژن هورمون رشد و بیان آن، از مدلهای مهم برای مطالعه رابطه سا ختمان و عمل پروتئین و تنظیم بیان ژن است، طی تحقیقی که سال ۱۹۹۳ توسط سونگ (Song) و همکارانش انجام شد جداسازی ژن هورمون رشد و تولید پلی پپتید آن به میزان بسیار زیاد در میکروارگانیسم ها بررسی شد. در سالهای اخیر در بسیاری از ماهیان این ژن از طریق cDNA کلون شده است. از جمله در یکی از فعالیتهای تحقیقاتی ژن هورمون رشد ماهی آزاد چنوک (Chinook salmon) از این طریق جدا و به باکتری اشیرشیاکلی تزریق شده است (Song 1993) در این تکنیک ابتدا cDNA هورمون رشد و جدا و کلون شد. cDNA 2/1 کیلو جفت باز بوده و در ساختار pSGH۴ طراحی شد. سپس دو تا پروب الیگونکلئوتیدی و پرایمر برای آن ساخته شد.
طراحی پروبها و پرایمرها بر اساس ردیف اسیدهای امینه به روش باندهای فسفر دی استری روی فاز جامد انجام گرفت. پروب A بر اساس ردیف رزیدوهای ۷-۱ و پرب B بر اساس رزیدوهای ۱۷۲-۱۶۶ طراحی شدند و به وسیله الکتروفورز روی ژل اکریل آمید خالص گردیدند. همچنین طراحی پرایمرهای ۱و۲ بر اساس الگوی cDNA انجام شد. سپس آمپلی فیکاسیون ژن هورمون رشد به وسیله PCR انجام و محصولات PCR به وسیله الکتروفورز روی ژل آگاروز چک و با اتانل رسوب داده شدند و در قدم بعدی پلاسمید لازم برای بیان ژن طراحی گردید. و ژن مدیفای شده cDNA هورمون رشد به وسیه آنزیمهای برش دهنده Bam HI , Eco RI برش به ناقل پلاسمیدی که آن هم به وسیله همین آنزیمها برش شده بود منتقل شد.
سپس پلاسمید طراحی شده به باکتری Ecoli JM105 وارد گریدند نو ترکیب به وسیله پروب نشانه گذاری شده A مشخص شدند. کلونهای که ژن به آنها وارد شده بود. به نام pmAK5 نامیده شدند. اگر چه جهت تأئید بیشتر مجدد این کلونها تحت اثر آنزیمهای برش دهنده قرار داده شدند و با پروب نشانه B هیربد شدند. سپس اشیرشیا کولی های Ecoli K12 – JM105 حاوی پلاسمید pmAK5 که دارای ژن هورمون رشد بودند در محیط کشت YT کلون شدند. پس از انکوباسیون باکتریها با ایزوپروپیل دی تیوگالاکتو پیرانوزید (IPTG) برای مدت ۴ ساعت در دمای ۳۷ درجه، سلولها جدا و در بافر لایملی (Laemmli 1971) حل و با SDS-PAGE و کماسی بررسی شدند. نتایج نشان داد که به طور تخمین میزان ۱۰-۶ درصد از مجموع تمام پروتئین سلولی در اشیرشیاکولی مربوط به ژن هومون رشد بوده است.
۳-۱- انتقال ژن به تخم ماهی از طریق میکروپیل با میکروپیپت
در سال ۱۹۹۸ بریم و همکاران در تحیقیقی ژن هورمون رشد انسان را از طریق میکروپیل به صفحه زایای ماهیان تیلاپیا انتقال دادند رشد ماهیان طی ۹۰ روز بررسی شد. جهت تکثیر، تعداد ۴ یا ۵ ماهی ماده را در کنار یک ماهی نر قرار دادند به طوریکه در شرایط آزمایشگاهی تخمک گذاری ماهیان ماده انجام و با اسپرم لقاح شدند. تخم های لقاح یافته ۱۰ دقیه پس از تخمک گذاری در شرایط مصنوعی برداشته شدند. تمام تخم ها به انکو باتورهای ویژه با جریان آب و دمای منتقل شدند و تا زمان دست کاری نگهداری گردیدند. تزریق به تخم ها در زمانهای ۱۰ دقیقه و ۲۴-۲۱ و ۴۳-۴۰ ساعت پس از تخمک گذاری انجام شد. ساختار پلاسمیدی که در انتقال ژن به تیلاپیا به کار گرفته شد بنام ۱- pXGH در تصویر ۴ نشان شده است. این پلاسمید دارای ۳۱/۹ کیلوباز شامل ۳۵/۲ کیلو باز از قطعه ای از BPV-1 که دارای دو محل ویژه برش توسط آنزیمهای EcoRI , Bam H1 می باشد. تصویر ۴- ساختمان پلاسمید pXGH-1 و جایگاههای مورد شناسایی آنزیمهای برش دهنده از طرف دیگر ۴۶/۲ کیلو باز آن از قطعه ای از پلاسمید pBR322 و ۴ کیلو باز آن که دارای دو محل ویژه برش توسط Eco RI در دو انتهای خود می باشد مربوط به پروموترمتالوتیونین موش mMTI و ژن هورمون رشد انسان hGH که به آن متصل کرده اند بوده است. اگر چه از این مقدار ۸/۱ کیلو باز آن مربوط به پروموترژن متالوتیونین موش و ۷/۱ کیلو باز آن مربوط به ژن ساختمانی هورمون رشد انسان بوده است. در ژن هورمون رشد نواحی اگزون و انترون و ترتیبات غیر قابل ترجه در طراحی شده بود همچنین در سمت ژن هورمون رشد انسان قطعه ای به اندازه ۵/۰ کیلو از فاژ طراحی شده که دارای محلهای ویژه ای جهت برش توسط آنزیمهای برش دهنده بوده است. علاوه بر این برای قطعه ای از ژن hGH که در اثر برش توسط دو آنزیم Bg1 II , Pvn II ایجاد می شود پروب طراحی شده بود تزریق در یک پتری دیش پر از آب به کمک استریومیکروسکوپ (Wild M8) و دو پیپت انجام شد. تخم ها به کمک یک میکروپیپت نگهدارنده که سر آن به شکل فنجان طراحی شده بود مکش و تثبیت و از حرکت آنها به طرفین جلوگیری شد. سپس به کمک میکروپیپت دوم به قطر ۵ میکرومتر محلول حاوی DNA از طریق میکروپیل به صفحه زایای تخم ها تزریق شد. مقدار تقریبی ۱۰۶ کپی از DNA به کمک فشار هوا به هر تخم تزریق شده است. جزئیات تزریق و هچ تا مرحله ۹۰ روز در جدول شماره ۲ ذکر شده است.
مقدمه‌ای بر بیوتکنولوژی انتقال ژن در ماهی
فهرست مطالب
عنوان صفحه
بخش اول: دست کاریهای ژنی در ماهیان
مقدمه………………………………………………………………………………………………….
۱-۱- به کار گیری پروموتر از ژن ماهیان……………………………………………..
۲-۱- بیان ژن هورمون رشد ماهی در باکتری………………………………………..
۳-۱- انتقال ژن به تخم ماهی از طریق میکروپیل با میکروپیپت…………………
۴-۱- انتقال ژن از طریق اسپرم با انکوبه کردن آن در سیستم بافری………..
۵-۱- انقال ژن از طریق اسپرم با الکتروپورشن در سیستم بافری…………….
۶-۱- انتقال ژن به تخم ماهی از طریق الکتروپورش……………………………….
۷-۱- انتقال ژن به تخم ماهی از طریق میکروپیل با میکرواینجکشن…………..
۸-۱- بررسی امکان وراثت ژن منتقل شده به نسل ها بعد………………………..
بخش دوم : دست کاریهای کروموزومی در ماهیان
۱-۲- دست کاریهای جنسی…………………………………………………………………..
۱-۱-۲- دست کاریهای جنسی با تکنیک ژینوژنز……………………………………..
۲-۱-۲- دست کاریهای مجموعه کروزومی به وسیله تکنیک اندروژنز……….
۲-۲- پلوئیدی………………………………………………………………………………………
۱-۲-۲- تریپلوئیدی……………………………………………………………………………..
۲-۲-۲- تتراپلوئیدی…………………………………………………………………………….
بخش سوم: کلونینگ
مقدمه………………………………………………………………………………………………….
۱-۳- ایجاد کلون به وسیله دوژینوژنز متوالی…………………………………………
۲-۳- کلون کردن به وسیله ترکیبی از اندروژنز و ژینوژنز………………………
۳-۳- جابجایی هسته…………………………………………………………………………….
۴-۳- جابجایی سلولهای سوماتیک جنینی به جنین دیگر……………………………
۵-۳- دورگه گیری………………………………………………………………………………
۴- منابع………………………………………………………………………………………………
- در صورتی که به هر دلیلی موفق به دانلود فایل مورد نظر نشدید با ما تماس بگیرید.
