دانش رسان |
مرکز علم و دانش کشور مقاله بررسی تنوع زیستی باکتریهای نمک دوست نسبی و تحمل کننده نمک قابل کشت در تالاب پرشور اینچه برون
در حال بارگذاری
توجه : به همراه فایل word این محصول فایل پاورپوینت (PowerPoint) و اسلاید های آن به صورت هدیه ارائه خواهد شد
مقاله بررسی تنوع زیستی باکتریهای نمک دوست نسبی و تحمل کننده نمک قابل کشت در تالاب پرشور اینچه برون دارای ۱۷ صفحه می باشد و دارای تنظیمات در microsoft word می باشد و آماده پرینت یا چاپ است
فایل ورد مقاله بررسی تنوع زیستی باکتریهای نمک دوست نسبی و تحمل کننده نمک قابل کشت در تالاب پرشور اینچه برون کاملا فرمت بندی و تنظیم شده در استاندارد دانشگاه و مراکز دولتی می باشد.
توجه : در صورت مشاهده بهم ریختگی احتمالی در متون زیر ،دلیل ان کپی کردن این مطالب از داخل فایل ورد می باشد و در فایل اصلی مقاله بررسی تنوع زیستی باکتریهای نمک دوست نسبی و تحمل کننده نمک قابل کشت در تالاب پرشور اینچه برون،به هیچ وجه بهم ریختگی وجود ندارد
بخشی از متن مقاله بررسی تنوع زیستی باکتریهای نمک دوست نسبی و تحمل کننده نمک قابل کشت در تالاب پرشور اینچه برون :
برای تضمین تولید مواد غذایی و دارویی در آینده و توسعه کشاورزی و صنعت، حفظ ذخایر توارثی موجود در طبیعت بکر و دست نخورده، امری ضروری است. بی شک تاریخچه تکامل طولانی میکروارگانیسم ها و تواناییهای متابولیکی گسترده شان و نقش مهمی که در چرخه عناصر، پالایش زیستی، تولید آنتی بیوتیک ،تولید فرآورده های تخمیری و خوراکی، همزیستی با گیاهان، بیابان زدایی و افزایش حاصلخیزی خاک و;. ایفاء می کنند، اصلی ترین دلایل اهمیت بررسی تنوع زیستی میکربی بوده است(.(۲۸ امروزه یکی از شاخصهای سلامت هر زیستبوم و پایداری آن، تنوع میکروارگانیسمهای آن در نظر گرفته می شود. بهطوری که زیستبومهای با تنوع
کمتر، محیطهایی در معرض خطر، حساس و نیازمند مراقبت خاص محسوب میشوند. رفتارهای انسانی و یا عوامل طبیعی که زیستبومها را به سوی کاهش تنوع میکربی آن هدایت میکنند، می توانند منجر به تخریب زیستبوم و یا بروز همهگیریها و آفتها شوند ۲) و .(۱۷
یکی از چالشهای عمده در تعیین تنوع زیستی میکروارگانیسمها، مشکل جداسازی آنهاست . رایجترین روش برای شناسایی انواع میکروارگانیسمها، تهیه کشت از نمونه خاک، آب، رسوب و رشد روی محیط جامد حاوی ترکیبات مغذی است که انواع مختلفی از میکروارگانیسمها روی آن قادر به رشد هستند. در طول سالهای اخیر، بررسی
۴۴
مجله پژوهشهای سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران) جلد ۲۷، شماره ۱، ۱۳۹۳
تنوع زیستی پروکاریوتها با روشهای مولکولی، بیشتر بر اساس تکثیر ژن ۱۶S rRNA و تعیین توالی ژنی سویهها انجام شده است (۵ آنچه که روشهای وابسته به کشت از جامعه میکربی نشان میدهند بخش بسیار کوچکی از جامعه میکربی است که توان سازگاری بیشتری با شرایط کشت مصنوعی داشته اند که نمی توان آنها را نمونه شاخصی از وضعیت کلی دانست اما توسعه روشهای کشت به خصوص جایی که گروههای جدید میکربی مدنظر هستند به همراهی روشهای مولکولی ضروری است ۲) و .(۲۹
در زیست محیطهای آب و خاک ، فاکتور شوری تعیین کننده جمعیتهای میکربی محسوب می شود. خاکهای دارای بیش از ۰/۲ درصد نمک محلول، خاک شور نامیده می شود که در سراسر جهان و به ویژه در مناطق خشک فراوان وجود دارد .(۲) اقیانوسها، دریاها، دریاچه های شور و مردابهای نمک از جمله محیطهای آبی شور شناخته شده اند. دریاچه های با میزان نمک بالا ی ۰/۳ درصد جزء دریاچه های شورمحسوب می شود. آبهای پرشور، تراکم نمک بسیار بالاتری نسبت به آب دریا دارند تنوع موجودات نمک دوست وتحمل کننده نمک در اکوسیستمهای آبی و خاکهای شور بسیار گسترده بوده و مجموعه ای از موجودات ماکروسکوپی ومیکروسکوپی را در برمی گیرد ۲) و .(۲۲ امروزه مطالعه بر روی میکروارگانیسم های نمک دوست به دلیل تواناییهای ویژه ای که در تحمل شرایط دشوار، تولید انواع متابولیت ها، تجزیه ماکرومولکول های گوناگون و پالایش زیستی دارند در جنبه های مختلف فیزیولوژی، اکولوژی، ژنتیک و بیوتکنولوژی توسعه یافته است .(۵)
از بررسیهای انجام گرفته بر روی مناطق پرشور ایران می توان به بررسی تنوع زیستی میکروارگانیسمهای نمک دوست قابل کشت و غیر قابل کشت سواحل غربی در یاچه ارومیه (۹) و تولید آنزیمهای هیدرولیتیک در باکتریهای نمک دوست این دریاچه اشاره کرد .(۷)
همچنین دریاچه فصلی حوض سلطان (۶)، دریاچه نمک آران و بیدگل ۱)، ۲و(۵ و دریاچه بختگان واقع در غرب نی ریز (۴) نیز از نظر تنوع میکروارگانیسمهای نمک دوست وتحمل کننده نمک و تولید آنزیمهای هیدرولیتیک بررسی شده اند.
از مطالعاتی که بر روی تحمل پذیری و مقاومت هالوفیلها نسبت به ترکیبات سمی انجام گرفته می توان به بررسی مقاومت به اکسی آنیونهای سمی تلوریت ، سلنیت ، سلنات ، ارسنات و کرومات در باسیلوس های هالوفیل بومی ایران
(۸) بررسی احیاء کروم شش ظرفیتی توسط باکتری هالوفیل نسبی مقاوم به کروم Nesterenkonia sp. strain (10) MF2 و بررسی اثر اکسی آنیونهای مختلف بر مقاومت به تلوریت در باکتریهای نمک دوست :
Halomonas elongate، Halomonas maura ، Halobacillus litoralis Virgibacillus salexigenes ، Halobacillus karajensis ، Halobacillus halophillus
، Bacillus halophillus ، Salinococcus iranensis ، Salinivibrio proteolyticus اشاره کرد( .( ۸
اهدف اصلی این پژوهش، بررسی یک اکوسیستم پرشور (
تالاب اینچه برون ) از نظر گوناگونی میکروارگانیسم های ساکن و درک گوشه ای از تنوع زیستی موجود در آن ، شناسایی توانمندی میکروارگانیسم های نمک دوست در تولید متابولیتهای ثانویه و امکان دستیابی به جنس و گونه های جدید برای افزودن به ذخایر ژنتیکی کشور در راستای در اختیار داشتن یک بانک میکربی غنی و بی نیازی از خرید سویه از بانکهای میکربی خارج از کشور بوده است.
مکان انجام این پژوهش تالاب پر شور اینچه برون است که در ۲۵ کیلومتری شمال شهر آق قلا ، در فاصله ۳
کیلومتری شرق جاده آق قلا – مرز پل در استان گلستان (
N :37.8.57 و ( E: 54.51
واقع گردیده است .این تالاب حدود ۱۰۰ هکتار مساحت دارد و ارتفاع عمیق ترین نقطه تالاب از سطح دریای آزاد
۵۴
مجله پژوهشهای سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران) جلد ۲۷، شماره ۱، ۱۳۹۳
۴ متر است و در طبقه بندی کنوانسیون رامسر در گروه نمونه گیری: در اواخر شهریور ۱۳۸۹ از آب، خاک ، لجن
تالابهای داخلی لب شور و دائمی قرار می گیرد .(۳) سطحی وعمقی ، کریستالها ولایه ضخیم نمک، ۴ منطقه
مواد وروشها این تالاب نمونه گیری انجام شد. تصویر ماهواره ای تالاب
و نقاط نمونه برداری در شکل ۱ نشان داده شده است
(شکل .(۱
شکل -۱ تصویر ماهواره ای از تالاب اینچه برون و مناطق نمونه برداری
نمونه ها در دمای محیط و در حداقل زمان به آزمایشگاه منتقل شد و pH و شوری آنها اندازهگیری گردید. آنالیز شیمیایی نمک دریاچه جهت سنجش عناصر موجود در محیط زیست طبیعی باکتریهای این دریاچه و به کار گیری آن در طراحی محیط کشت مناسب که امکان جداسازی طیف گستردهتری از باکتریها را فراهم سازد، توسط شرکت بهین خاک آزما صورت گرفت .
خالص سازی و شناسایی سویه ها: از نمونه های منتقل شده به آزمایشگاه برای جدا سازی و کشت باکتریهای نمک دوست نسبی و تحمل کننده نمک، تا رقت ۱۰-۶
سری رقت تهیه شد. برای کشت وخالص سازی از محیط جامد Moderate halophiles(12% salt) شامل(گرم در لیتر): ۱۰۴ : NaCl، ۵/۴ : MgCl2.6H2O، MgSO4.7H2O
۸/۳ :، ۰/۴۱ : CaCl2.2H2O، ۱/۶۶ : KCl، : NaHCO3 0/08، ۵ :Yeast Extract، ۱ :Glucose، Peptone from
۸ :meat و ۱۵ :Agar برای جداسازی نمک دوستهای
نسبی ومحیط جامد Seawater Nutrient Agar (3% salt)
شامل(گرم در لیتر): : ۲۰ : NaCl، ۳ : MgCl2.6H2 O،
۵ : MgSO4.7H2 O، ۰/۵ : CaCl2.2H2O، ۰/۵ : KCl، ۱ :Yeast Extract، : Peptone from 2 Meat :Extract
۵ :meat و ۱۵ :Agar برای جداسازی تحمل کننده های نمک استفاده گردید(.(۲
افتراق جدایههای تحمل کننده نمک و نمک دوست
نسبی: باکتریهای تحمل کننده نمک علاوه بر توانایی رشد در محیط فاقد نمک می توانند غلظتهای بالای نمک را نیز تحمل کرده و در این شرایط نیز رشد کنند. به این دلیل که در ترکیب مواد مورد استفاده در تهیه محیط کشت مثل پپتون، عصاره مخمر و عصاره گوشت نمک وجود دارد و این نمک می تواند نیازمندی به نمک را در باکتریهای نمکدوست پوشش دهد و موجب رشد آنها در محیط فاقد نمک گردد، از محیطی که فقط دارای ۵ گرم در لیتر عصاره مخمر بود استفاده شد. این محیط کشت با درصدهای نمک
۰، ./۵،۳ ، ۵، ۷/۵، ۱۰، ۱۵، ۲۰ تهیه شد، pH محیط با استفاده از سود دو نرمال و HCl یک نرمال در ۷/۵ تنظیم شد و در دمای ۱۲۱ درجه سانتی گراد و به مدت ۱۵ دقیقه اتوکلاو گردید. نکتهای که در افتراق این باکتریها مدنظر قرار گرفت بهینه رشد بود، زیرا تنها توانایی رشد در محیط فاقد نمک برای اینکه یک جدایه را تحمل کننده نمک در نظر گرفت، کافی نیست . برای انتخاب محیط بهینه از نظر درصد نمک، پس ازگذشت ۱۲ ساعت از
۶۴
۱۶S rRNA
پرایمر۱۴۸۸R با ترادف :
Schaeffer-Fulton
مجله پژوهشهای سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران) جلد ۲۷، شماره ۱، ۱۳۹۳
زمان کشت، هر یک از این محیطها مورد مقایسه قرارگرفت و نمکی بهینه انتخاب شد که اولین رشد پایدار باکتری در آن درصد نمک صورت گرفته باشد ۲)و.(۵ از ۴۰۰ جدایه خالص شده ، ۵۵ سویه به صورت تصادفی برای تعیین ترادف ژن ۱۶S rRNA ومطالعات تکمیلی انتخاب گشته و پس از استخراج DNA ، انجام PCR و تعیین ترادف نتایج حاصله با توالیهای ثبت شده در بانکهای اطلاعاتی مقایسه گردید.
مطالعات فیلوژنتیک: پس از تهیه توده زیستی،
استخراج DNA باکتریها، طبق روش دستورزی شده پیشنهاد شده توسط Marmur (1994) انجام گرفت .(۲۰)
جهت تأیید استخراج انجام شده، الکتروفورز ژل آگارز
براساس روش (۱۹۹۷) kolmodin صورت گرفت .(۱۹)
برای تکثیر ژن ۱۶S rRNA از پرایمر های عمومی ۲۷F
باترادف:AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG ،
CGG TTA CCT TGT TAC
GAC TTC ACC وپرایمر ۱۴۹۲R با ترادف: GGT TAC
CTT GTT ACG ACT T استفاده شد .(۲۵) به دلیل اینکه تمام سویه ها با یک جفت پرایمر تکثیر نشد دو جفت پرایمر ۲۷F -1492R و ۲۷F-1488R به کار گرفته شد. با استفاده از این پرایمرها ژن ۱۶S rRNA با طول حدود ۱۵۰۰ نوکلئوتید تکثیر شد. برای حصول اطمینان از عدم آلودگی مواد مورد استفاده در PCR شاهد منفی با افزودن آب به جای DNA الگو در ویال حاوی مخلوط واکنش به کار رفت. دمای اتصال پرایمرها ، مدت زمان اتصال وسنتز برای هر سویه به طور جداگانه بهینه گردید.
تعیین توالی محصول PCR از طریق شرکت ژن فن آوران انجام شد. ترادفهای به دست آمده با استفاده از نرم افزار
Chromasمرتب شده و با نرم افزار BLAST با توالیهای ثبت شده موجود در پایگاه اطلاعات ژنومی GenBank و Eztaxon مقایسه شد. به این ترتیب نزدیکترین سویهها
با ترادف ژن مشابه با سویههای منتخب PCR
شده تعیین شد. آنالیز فیلوژنتیک باکتریهای منتخب با سویههای نزدیک به آنها با استفاده از نرم افزار Clustal x
(ویرایش دوم) صورت گرفت. درخت فیلوژنی با استفاده از نرم افزار MEGA (ویرایش پنجم) با الگوریتمهای Maximum likelihood و Maximum parsimony رسم گردید .(۲۷) بررسی اعتبار شاخههای درخت با استفاده الگوریتم Bootstrap analysis و با ۱۰۰۰ بار نمونهگیری صورت گرفت .(۱۳)
جدایه های منتخب با آزمایشهای ریخت شناسی و بیوشیمیایی نظیر بررسی شکل کلنی، رنگ آمیزی گرم بر اساس روش (۲۱) Hucker، بررسی شکل میکروسکوپی باکتری، حرکت سلول باکتری به روش لام مرطوب (۱۴)،
رنگ آمیزی اسپور بر اساس روش
(۱۴)، تولید کاتالاز با محلول ۳ درصد پراکسید هیدروژن
(۱۶)، تست اکسیداز با استفاده از دیسکهای آماده (۱۵)
احیای نیترات و شرایط بهینه رشد از نظر دما ، میزان نمک
و pH بررسی گردیدند. تولید آنزیمهای هیدرولازی آمیلاز
، پروتئاز ، لیپاز و ژلاتیناز مطابق با دستور ذکر شده در جدول ۱ بررسی گردید. بسته به نیاز سویه NaCl به محیطهای آنزیمی افزوده شد و پس از تلقیح همگی به مدت ۲ هفته در دمای ۳۵ درجه سانتی گراد گرما گذاری شدند. (جدول (۱
نتایج
جداسازی و شناسایی: با توجه به نتایج حاصل از آنالیز آب، به دلیل بالا بودن میزان یونهای Na+ و-Cl ، تالاب اینچه برون در گروه مناطق پرشور تالازوهالین با منشاء دریایی قرارمی گیرد.
محل ۴ با ۵۱۰۵ cfu باکتری بیشترین بار میکربی را داشت وکمترین تعداد جدایه متعلق به نمونه برداری از منطقه ۱
بود . در مجموع ۴۰۰ جدایه خالص سازی گردید که بیشترین جداسازی از محیط MH با ۱۲ درصد نمک و pH
۷۴
مجله پژوهشهای سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران) جلد ۲۷، شماره ۱، ۱۳۹۳
۵/۵ انجام گرفت. با توجه به نتایج ذکر شده در جدول ۲، بیشتر جدایه ها باسیلهای گرم مثبت بودند (جدول .(۲
آنزیم
آمیلاز
پروتئاز
لیپاز
ژلاتیناز
شکل -۲ نمودار فراوانی و تنوع جنسهای جدا شده از پژوهش
جدول -۱ ترکیب محیطهای کشت بررسی تولید آنزیم
محیط تولید آنزیم(گرم در لیتر ) روش تشخیص
Beef extract : 3 Soluble starch : 10 , افزودن لوگل ( یدید پتاسیم) بر روی محل رشد
Agar : 15
باکتری و ایجاد هاله شفاف پاسخ مثبت در نظر
پس از آماده سازی pH محیط بر روی ۷/۵ تنظیم شده و در دمای ۱۱۵ درجه
گرفته شد.
سانتی گراد برای مدت ۱۰ دقیقه اتوکلاو شد(.(۱۲
Meat extracts : 3 , Peptone : 5 , Skim milk : 20
Agar : 15 وجود هاله شفاف در اطراف کلونیها نشانه
پودر Skim Milk در نیمی از حجم آب محیط حل شده و در دمای ۱۱۰ درجه
هیدرولیز پروتئین کازئین بوده و به عنوان پاسخ
سانتی گراد به مدت ۱۰ دقیقه اتوکلاو شد و بعد از آن به محیط پایه آگاردار که
مثبت در نظر گرفته شد
پس از آماده سازی بر روی ۷/۵ pH تنظیم شده در دمای ۱۲۱ درجه سانتی
گراد، ۱۵ دقیقه اتوکلاو شده است، اضافه شد(.(۲۴
CaCl2.H2O: 0/1 , Peptone :10, Tween 80: 10
۱۵ Agar : ایجاد نواحی رسوب اطراف کلنی ها، به صورت
توئین موجود در این محیط بعد از تهیه در دمای ۱۱۵ درجه سانتی گراد به مدت دانه های سفید همراه با هاله کدر نشان دهنده
۲۰ دقیقه اتوکلاو شد. محیط پایه نیز پس از آماده سازی بر روی ۷/۵ pH تنظیم تولید آنزیم لیپاز توسط باکتری است.
شده و به صورت جداگانه در دمای۱۲۱ درجه سانتی گراد به مدت ۱۵ دقیقه
اتوکلاو شد. دو محیط پس از اتوکلاو به هم اضافه شد(.(۲۳
Meat extracts : 3 , Peptone : 5 , Gelatin : 120 محیطهای رشد کرده را به همراه یک نمونه منفی
محیط ابتدا آب تا دمای نزدیک جوش گرم شده و نمک و محیط کشت به آرامی
به این ترکیب اضافه شد. pH محیط آماده شده بر روی میزان ۷/۵ تنظیم شده و در دمای ۴ درجه سانتی گراد قرار داده پس از
برای ۱۵ دقیقه در دمای ۱۲۱ درجه سانتی گراد اتوکلاو شد. محیط آماده شده به ۲۰ دقیقه در صورت مایع بودن محیط نتیجه
روش Stab کشت داده شد. (۲۴) تست مثبت گزارش شد.
۸۴
مجله پژوهشهای سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران) جلد ۲۷، شماره ۱، ۱۳۹۳
جدول – ۲ مختصات مناطق نمونه برداری وتعداد جدایه های خالص سازی شده
به تفکیک محل و نتایج لام گرم
منطقه نمونه مختصات جغرافیایی میانگین شوری میانگین pH باسیل گرم باسیل گرم کوکوس گرم جمع
برداری منفی مثبت مثبت
بستر نمکی ۱۷ ۲۲ ۲ ۴۱
محل ۱ N :37.13.438 E: 26.8 4.2 24 35 6 65
۵۴.۳۰.۲۲۴
محل ۲ N: 37.13.932 E: 28.7 5.2 40 50 5 95
۵۴.۳۰.۰۸۱
محل ۳ N :37.13.829 28.4 5.2 39 37 2 78
E:54.30 .307
محل ۴ N: 37.13.517 E: 23.3 6.45 64 50 7 121
۵۴.۳۰.۶۵۷
جمع کل ۱۸۴ ۱۹۴ ۲۲ ۴۰۰
بررسی فیلوژنی: در ۵۵ سویه ترادف ژن ۱۶S rRNA بدون انجام هیبریداسیون DNA-DNA با گونههای نزدیک،
مورد بررسی قرار گرفت که با توجه به نتایج در ۱۵ جنس می توانند به عنوان گونههای جدید مطرح شوند .(۲۶) در
قرار گرفتند. ، از این تعداد جنسهای Micrococcus و این مطالعه براساس شباهتهای فنوتیپی در میان سویه های
Rhodococcus فقط از محل ۱ جدا شده اند .جنسهای تعیین ترادف شده ، در نهایت ۲۲ سویه نمک دوست نسبی
Kocuria و Dietzia فقط محل ۳ و ۴ و Desmospora و و۳۳ سویه تحمل کننده نمک جدا گردید که در نمک
Chromohalobacter فقط از محل ۴ جدا شدند. تنوع دوستهای نسبی بیشترین فراوانی متعلق به جنسهای
وفراوانی جنسهای جداشده در شکل ۲ آورده شده است Marinobacter و Halomonas بود وعمده ترین تحمل
(شکل .(۲ کنند ه های نمک به جنسهای Oceanobacillus , Dietzia,
از ۵۵ سویه تعیین ترادف شده ، ۱۳ سویه که متعلق به Bacillus و Kocuria قرابت داشتند .سویه های تعیین
ترادف شده از نظر سیستماتیک در ۳ رده ۴۰) درصد
گونه های مختلف از ۵ جنس , Virgibacillus Bacillus
Firmicutes(، ۲۴) درصد)Actinobacteria و رده ۳۶)
,Dietzia Oceanobacillus و Halomonase بودند ،
درصد)-Proteobacteria قرار گرفتند . اغلب سویهها
شباهتی ۱۰۰ درصد در ترادف ۱۶S rRNA داشتند، که
متعلق به رده Firmicutes بودند که درختهای فیلوژنی رسم
آنها را از نظر ارائه به بانک میکربی به عنوان
شده به روشMaximum likelihood برای هر رده و
میکروارگانیسم بومی شناسایی شده حائز اهمیت می سازد.
محل قرار گرفتن سویه های بررسی شده در آن، در
همچنین در ۱۳ سویه که متعلق به ۳ جنس Bacillus,
شکلهای۳، ۴ و۵ نشان داده شده است (شکلهای۳، ۴ و.(۵
اشتراک‌گذاری:
- در صورتی که به هر دلیلی موفق به دانلود فایل مورد نظر نشدید با ما تماس بگیرید.
