دانش رسان |
مرکز علم و دانش کشور مقاله مطالعه روند رویان زایی میکروسپورهای کلزا رقم پی اف (PF704) در شرایط درون شیشه ای با استفاده از میکروسکوپ الکترونی
در حال بارگذاری
توجه : به همراه فایل word این محصول فایل پاورپوینت (PowerPoint) و اسلاید های آن به صورت هدیه ارائه خواهد شد
مقاله مطالعه روند رویان زایی میکروسپورهای کلزا رقم پی اف (PF704) در شرایط درون شیشه ای با استفاده از میکروسکوپ الکترونی دارای ۱۴ صفحه می باشد و دارای تنظیمات در microsoft word می باشد و آماده پرینت یا چاپ است
فایل ورد مقاله مطالعه روند رویان زایی میکروسپورهای کلزا رقم پی اف (PF704) در شرایط درون شیشه ای با استفاده از میکروسکوپ الکترونی کاملا فرمت بندی و تنظیم شده در استاندارد دانشگاه و مراکز دولتی می باشد.
توجه : در صورت مشاهده بهم ریختگی احتمالی در متون زیر ،دلیل ان کپی کردن این مطالب از داخل فایل ورد می باشد و در فایل اصلی مقاله مطالعه روند رویان زایی میکروسپورهای کلزا رقم پی اف (PF704) در شرایط درون شیشه ای با استفاده از میکروسکوپ الکترونی،به هیچ وجه بهم ریختگی وجود ندارد
بخشی از متن مقاله مطالعه روند رویان زایی میکروسپورهای کلزا رقم پی اف (PF704) در شرایط درون شیشه ای با استفاده از میکروسکوپ الکترونی :
مقدمه
سیتوکینز غیر قرینه میکروسپورهای کلزا پس از اولین مراحل رشد و نمو خاصی ممکن است ۱۰) و .(۱۱
تقسیم میتوز دانه گرده، یک سلول رویشی بزرگ با یک محققین (۲۲) نشان داده اند که در کشتهای میکروسپوری
هسته حاوی کروماتین پراکنده و یک سلول زایشی کوچک که تقریباٌ ۲۰ درصد از میکروسپورها به طرف رویان رشد و
با کروماتین فشرده ایجاد می کند. سلول زایشی سپس نمو پیدا می کنند، نسبت بالایی از میکروسپورها در مرحله
تقسیم شده و دو سلول اسپرماتوزوئید را در دانه گرده سه تک هسته ای انتهایی یا در حال تقسیم و یا ابتدای دو
سلولی ایجاد می کند ۲۲) و .(۲۴ میکروسپور تحت هسته ای می باشند. گزارشات متفاوتی در مورد
استرس دمایی در شرایط درون شیشه ای می تواند برنامه مورفولوژی میکروسپورهای مرحله تک هسته انتهایی در
رشد و نموی خود را به طرف رویان زایی تغییر داده و واریته های مختلف کلزا وجود دارند. میکروسپورهای تک
تولید رویانهای هاپلوئید نماید .(۵) در بیشتر گونه های هسته ای انتهایی کلزا در واریته وستار (Westar) حاوی
گیاهی تغییر برنامه میکروسپور برای رویان زایی تنها در ذرات نشاسته و تعداد زیادی واکوئل خیلی کوچک بود
۸۸
مجله پژوهشهای سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران) جلد ۲۷، شماره ۱، ۱۳۹۳
(۱۶)، در حالی که میکروسپورهای واریته تاور (Tower)
(۱۲) و واریته توپاس (۲۲) (Topaz) در این مرحله رشد و نمو فاقد هر گونه نشاسته و واکوئل کوچکی بودند.
مطالعات دیگر با واریته توپاس (۲۴) نشان دادند که یک واکوئل بزرگ، بلافاصله قبل از اولین تقسیم میتوز گرده از نظر اندازه کوچک شد و این واکوئل در میکروسپور های دو هسته ای نیز حضور داشت. همچنین این محققین در سالهای (۲۴) ۱۹۹۰ و (۲۵) ۱۹۹۱ با مطالعه بر روی رقم توپاس نشان دادند که رویانهای میکروسپوری از میکروسپورهای مرحله تک هسته ای انتهایی واکوئل دار منشاء گرفته اند. در کلزا، که به عنوان یک گیاه مدل در القای رویان زایی میکروسپور مطرح می باشد، حداقل ۸
ساعت تیمار دمایی در دمای ۳۲ درجه سانتی گراد لازم است تا مسیر رشد و نموی میکروسپورها به طرف رویان زایی تغییر نماید .(۷) این تغییر برنامه میکروسپورها با یک سری تغییرات مشخص همراه است که فعالیتهای مختلف سلولی و سازماندهی ساختاری اجزای داخل سلول را تحت تأثیر قرار می دهد و این تغییرات می توانند به عنوان نشانگرهایی برای فرآیند رویان زایی میکروسپور در نظر گرفته شوند ۴)، ۱۹ و .(۲۳ بعد از اعمال استرس القایی در شرایط درون شیشه ای، بعضی از میکروسپورها به طرف مسیر رویان زایی می روند در حالی که بعضی دیگر به تیمار استرس القایی حساس نبوده و مسیر های رشد و نموی مختلفی را در پیش می گیرند. اگر کشت میکروسپورها در دمای ۱۸ درجه سانتی گراد انجام شود میکروسپورها مسیر رشد و نموی گامتوفیتی را در پیش می گیرند .(۷) چندین مطالعه، جنبه های مختلف مسیر رشد و نمو رویان زای میکروسپورها را در شرایط استرس مورد بررسی قرار داده اند ۱۹)، ۲۰ و (۲۱، اما توجه کمی به دیگر مسیر های رشد و نموی میکروسپورها در شرایط درون شیشه ای، تحت هر دو شرایط القایی و غیر القایی شده است. در تحقیق حاضر، تغییرات ساختاری میکروسپورهایی که به طرف مسیر رویان زایی کلید می
خورند و همچنین دیگر مسیرهای رشد و نموی میکروسپورها در شرایط درون شیشه ای با مسیر رشد و نموی گامتوفیتی در شرایط درون شیشه ای و برون شیشه ای (in vivo) با استفاده از مشاهدات میکروسکوپ الکترونی مقایسه شده و تفاوتهای موجود در اندازه و شکل سلولی، معماری هسته، تجمع نشاسته و حضور واکوئلها جهت شناسایی مراحل متوالی مسیر رویان زایی میکروسپورها و مسیر های رشد و نموی دیگر مورد بررسی قرار می گیرند.
مواد و روشها
شرایط رشد گیاهان مادری: این آزمایش در مؤسسه
حفاظت و بهبود کشت و تنوع زیستی دانشگاه پلی
تکنیک والنسیا در کشور اسپانیا انجام گردید. رقم کلزای بهاره پی اف (Brassica napus L. cv. PF704) که در آزمایشات رویان زایی میکروسپور نتایج بسیار خوبی نشان داده بود ۱)و (۲، در بررسی مکانیسم رویان زایی میکروسپورهای کلزا با میکروسکوپ الکترونی مورد استفاده قرار گرفت. گیاهان مادری در اتاق رشدی با ۵۵۰۰
لوکس (۳۰۰ Em- 2S-1) نور و فتوپریود ) ۱۶ / ۸ h
تاریکی/ روشنایی ) با دمای ۱۵ / ۱۰ درجه سانتی گراد (
شب / روز )رشد کردند.
کشت میکروسپور : کشت میکروسپور با روش عبداللهی و همکاران ۱)و (۲ انجام گردید. بدین ترتیب که ۱۰۰ عدد غنچه با اندازه ۳/۵ـ۲/۵ میلیمتری، حاوی میکروسپورهای رویان زا ، از گیاهان کشت شده در اتاق رشد in vivo
انتخاب گردیدند. این غنچه ها با سدیم هیپوکلریت ۵/۲۵
درصد ( وایتکس ) به مدت ۱۰ دقیقه، ضد عفونی شدند و سپس دو مرتبه با آب مقطر سترون و سرد شده در دمای ۴
درجه سانتی گراد ، هر مرتبه به مدت ۵ دقیقه، شستشو داده شد. غنچههای سترون شده توسط یک آسیاب حاوی ml
۳۰ محیط جداسازی میکروسپورها (۸) طی ۳ مرتبه ۱۰
ثانیهای آسیاب شد. سوسپانسیون حاصل از آسیاب کردن
۸۹
مجله پژوهشهای سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران) جلد ۲۷، شماره ۱، ۱۳۹۳
غنچهها، به ترتیب از دو الک آزمایشگاهی با سوراخهایی به قطر ۱۰۶ و ۵۳ میکرومتر که بر روی هم قرار داشتند، عبور داده شد. در مرحله بعد، سوسپانسیون میکروسپورها به وسیله پیپتور و پیپت برداشته شد و به لولههای سانتریفیوژ سترون ۲۵ ml) در هر لوله) منتقل شدند. سپس این لولهها به سانتریفیوژ منتقل گردیدند. دستگاه سانتریفیوژ روی ۱۲۷۰ rpm دور در دقیقه یا ۲۰۰ g تنظیم گردید و زمان آن روی ۴ دقیقه قرار داده شد. پس از اتمام ۴ دقیقه اول، لوله های سانتریفیوژ از دستگاه خارج گردیدند و به زیر لامینار ایرفلو منتقل شدند. میکروسپورها در ته لولهها رسوب کردند و محلول جداسازی به همراه مواد زائد در بالا قرار گرفت که این محلول به وسیله پیپت حذف شد و مجدداً به هر لوله، ۲۵ ml محلول جداسازی جدید اضافه گردید. این عمل ۳ مرتبه تکرار گردید. سپس تراکم میکروسپورها روی ۴۰۰۰۰ میکروسپور در هر میلی لیتر محیط کشت تنظیم گردید و سوسپانسیون حاوی میکروسپورها، با محیط کشت (۱۳) NLN-13 به حجم جدید رسانده شد و سوسپانسیون حاصل در داخل پتری دیش های شیشه ای به ابعاد ۱۰۰×۱۵ mm، به مقدار ml
۱۲/۵، توزیع گردید و دور آنها دو لایه پارا فیلم بسته شد و به انکوباتوری با دمای ۳۲ درجه سانتی گراد و تاریکی به مدت ۲ روز منتقل شدند. بعد از ۲ روز کشتها به دمای ۲۵
درجه سانتی گراد و تاریکی منتقل شدند.
آماده سازی میکروسپورها و رویانهای میکروسپوری
برای عکسبرداری با میکروسکوپ الکترونی: به منظور مطالعات فراساختاری میکروسپور های کلزا با میکروسکوپ الکترونی، نمونه های میکروسپوری به روش زیر تهیه شدند:
-۱ تثبیت (Fixation) میکروسپورها و رویانهای حاصل از کشت میکروسپور در مراحل مختلف رشد و نمو
در این مرحله میکروسپورهای کشت شده در روزهای ۱، ۳، ۵، ۷ و ۱۰ روز بعد از کشت میکروسپور با استفاده از
سانتریفیوژ از محیط کشت مربوطه استخراج گردیدند و سپس میکروسپورهای استخراج شده و رویانهای حاصل از کشت میکروسپور در مراحل مختلف رشد و نمو در محلول تثبیت کننده کارنووسکی (Karnovsky fixative)شامل پارافرمالدهید ۴ (paraformaldehyde)
درصد و گلوتارالدهید ۵ (glutaraldehyde) درصد در محلول کاکودیلیت ۰/۰۲۵ (cacodylate) مولار با اسیدیته
۷/۳ به مدت ۲ ساعت تثبیت گردیدند. سپس نمونه های میکروسپوری به مدت ۱ ساعت دوباره در محلول ۱ درصد اسمیوم تتروکسید((osmium tetroxide تثبیت شدند.
-۲ آبگیری نمونه های میکروسپوری و رویانها
(Dehydration) در اولین روز با استفاده از سریهای استون به صورت زیر انجام شد.
الف- استون ۳۰ درصد به مدت ۲ ساعت، ب- استون ۵۰
درصد به مدت ۳ ساعت، ج- استون ۷۰ درصد به مدت
۲/۵ ساعت و د- در نهایت استون ۱۰۰ درصد در سراسر شب
-۳ تیمار نمونه ها با سریهای استون و اپون در روز دوم به شرح زیر انجام گرفت:
الف- استون ۱۰۰ درصد به مدت ۴ ساعت، ب- تیمار نمونه ها با محلول استون- پروپیلن اکسید ۵۰- ۵۰)
درصد) به مدت ۵ دقیقه، ج- تیمار با پروپیلن اکسید ۱۰۰
درصد به مدت ۳۰ دقیقه و د- تیمار با استون %۱۰۰ (سه بار هر دفعه ۵ دقیقه)، ذ- تیمار نمونه ها با محلول استون-
اپون ۱۰- ۹۰) درصد) به مدت ۶ ساعت، ر- تیمار با محلول استون-اپون ۲۵-۷۵) درصد) در سراسر شب
-۴ در روز سوم نمونه های میکروسپوری و رویانها در سریهای اپون به ترتیب زیر تیمار گردیدند:
الف- اپون ۵۰ درصد به مدت ۴ ساعت، ب- اپون ۷۵
درصد به مدت ۴/۵ ساعت و ج- اپون ۱۰۰ درصد در سراسر طول شب
۹۰
مجله پژوهشهای سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران) جلد ۲۷، شماره ۱، ۱۳۹۳
-۵ در چهارمین روز نمونه ها به مدت ۸/۵ ساعت در اپون
(یک نوع رزین ) ۱۰۰ درصد و سپس در طول شب در محلول اپون ۱۰۰ درصد و سرعت دهنده (Accelerator)
قرار گرفتند.
-۶ در روز پنجم نمونه ها به مدت ۷/۵ ساعت در محلول اپون ۱۰۰ درصد حاوی سرعت دهنده (Accelerator)
قرار گرفتند.
-۷ پس از انجام عمل آبگیری با سریهای استون و اپون نمونه ها در داخل کپسولهایی از جنس پلی اتیلن گلیکول قرار گرفتند (Encapsulation) و به مدت ۳ روز در دمای
۶۰ درجه سانتی گراد به منظور عمل پلیمریزاسیون قرار گرفتند.
-۸ از نمونه های پلیمریزه شده، برشهایی به ضخامت ۰/۵
میکرومتر تهیه گردید(.(Cutting
-۹ در نهایت عکس برداری از برشهای تهیه شده با میکروسکوپ الکترونی مدل Jeol 1010 EM در ۸۰ KV
انجام گردید.
نتایج
رشد و نمو گامتوفیتی در شرایط درون شیشه ای: کشت میکروسپورها در مرحله تک هسته ای انتهایی واکوئل دار
(شکل (۱ A در دمای ۲۵ درجه سانتی گراد منجر به رشد و نمو آنها به صورت گامتوفیتی گردید، به طوریکه دو و سه روز بعد از کشت میکروسپور در دمای ۲۵ درجه سانتی گراد ، میکروسپورها به طرف ساختار هایی مشابه با دانه گرده دو سلولی (شکل(۱B و سه سلولی رشد و نمو پیدا کردند. این ساختارهای مشابه دانه گرده، حاوی هسته رویشی، زایشی، اسپرماتوزوئید ها و سیتوپلاسم متراکم بودند. ساختارهای چند سلولی یا رویانها در این کشتها مشاهده نشدند. در نواحی خاصی از سیتوپلاسم این دانه های گرده کشت شده، تجمعی از دانه های نشاسته مشاهده گردید (شکل .(۱C در سطح فراساختاری، تعداد بی شماری آمیلوپلاست بزرگ حاوی دانه های نشاسته
(شکل (۱C در سیتوپلاسم این گرده های رشد و نمو پیدا کرده درشرایط درون شیشه ای مشاهده گردید.
شکل -۱ کشت میکروسپورهای کلزا در دمای ۲۵ درجه سانتی گراد که منجر به رشد و نمو آنها به صورت گامتوفیتی گردید، (A یک میکروسپور مناسب برای رویان زایی که در مرحله تک هسته ای انتهایی حاوی یک واکوئل بزرگ است، (B رشد و نمو گامتوفیتی یک میکروسپور دوسلولی با تقسیم غیر قرینه حاوی سلول رویشی و زایشی که در دمای ۲۵ درجه سانتی گراد (شرایط غیر رویان زا) کشت شده است، (C رشد و نمو شبه گامتوفیتی یک میکروسپور غیر رویان زای کشت شده در دمای ۲۵ درجه سانتی گراد که با تجمع نشاسته در سیتوپلاسم همراه است. (V) واکوئل بزرگ، (Nu) هستک بزرگ، (E) اگزین، (VN) هسته رویشی، (GN) هسته زایشی، (S) نشاسته
رشد و نمو میکروسپورها در شرایط درون شیشه ای در دمای ۳۲ درجه سانتی گراد (حداقل به مدت ۸ ساعت)،
تحت استرس دمایی: در کشتهای میکروسپور انکوبه شده مخلوطی از مسیر های رشد و نموی متفاوت مشاهده
۹۱
مجله پژوهشهای سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران) جلد ۲۷، شماره ۱، ۱۳۹۳
گردید (شکل .(۲A-C تعداد زیادی از میکروسپورها یک میکروسپورهای توسعه یافته در شرایط ۲۵ درجه سانتی
برنامه رشد و نموی رویان زای را آغاز کردند اما این گراد بودند. در این کشتها هیچ دانه گرده دو سلولی یا سه
میکروسپور ها علی رغم داشتن یک سازماندهی ساختاری، سلولی در میان ساختارهای غیر رویان زا مشاهده نگردید و
شباهتهایی با رشد و نمو گامتوفیتی در شرایط درون شیشه این پدیده نشان دهنده این است که تقسیم میتوز گرده در
ای نشان دادند. این میکروسپورها حاوی دانه های نشاسته بیشتر موارد، بعد از تیمار گرمایی متوقف گشته است.
فراوان بودند (شکل (۳ و از این جنبه مشابه
اشتراک‌گذاری:
- در صورتی که به هر دلیلی موفق به دانلود فایل مورد نظر نشدید با ما تماس بگیرید.
