دانش رسان |
مرکز علم و دانش کشور مقاله جداسازی و شناسایی اولین باکتری بومی کنترل کننده عامل بیماری شانکر مرکبات، Xanthomonas citri subsp.citri
در حال بارگذاری
توجه : به همراه فایل word این محصول فایل پاورپوینت (PowerPoint) و اسلاید های آن به صورت هدیه ارائه خواهد شد
مقاله جداسازی و شناسایی اولین باکتری بومی کنترل کننده عامل بیماری شانکر مرکبات، Xanthomonas citri subsp.citri دارای ۱۰ صفحه می باشد و دارای تنظیمات در microsoft word می باشد و آماده پرینت یا چاپ است
فایل ورد مقاله جداسازی و شناسایی اولین باکتری بومی کنترل کننده عامل بیماری شانکر مرکبات، Xanthomonas citri subsp.citri کاملا فرمت بندی و تنظیم شده در استاندارد دانشگاه و مراکز دولتی می باشد.
توجه : در صورت مشاهده بهم ریختگی احتمالی در متون زیر ،دلیل ان کپی کردن این مطالب از داخل فایل ورد می باشد و در فایل اصلی مقاله جداسازی و شناسایی اولین باکتری بومی کنترل کننده عامل بیماری شانکر مرکبات، Xanthomonas citri subsp.citri،به هیچ وجه بهم ریختگی وجود ندارد
بخشی از متن مقاله جداسازی و شناسایی اولین باکتری بومی کنترل کننده عامل بیماری شانکر مرکبات، Xanthomonas citri subsp.citri :
مقدمه
سالانه بخش عمده ای از محصولات کشاورزی بر اثر آفات و بیماریهای گیاهی از بین می روند(.(۱ بیماری باکتریایی شانکر مرکبات بسیاری از گونه های مهم مرکبات از قبیل گریپ فروت، برخی پرتقالهای شیرین، لیموترش و لیموشیرین را آلوده می کند .(۵) باکتری عامل این بیماری
می باشد که دارای
دو تیپ متفاوت A وA* است، اگرچه سویه های تیپ A
در اغلب مناطق کشت و تولید مرکبات دیده می شود اما سویه های تیپA*، تنها در هند، تایلند و کشورهای حوضه خلیج فارس ازجمله ایران، شناسایی شده است. نتایج حاصله از مطالعات دیگر نشان می دهد که علاوه بر سویه های تیپ A*، سویه هایی با دامنه میزبانی وسیع (تیپ ( A
و تیپهای متنوع دیگر نیز در کشور وجود دارد .(۲) حفاظت
گیاهان علیه این نوع پاتوژن، توسط ترکیبات مسی و آنتی بیوتیکها مقدور می باشد که هر دو مورد، جزء ترکیبات آلوده کننده محیطی به شمار می رود و در چندین مورد گزارش شده است که این ترکیبات به تولید نژادهای مقاوم باکتریهای پاتوژن گیاهی منجر شده اند. در سالهای اخیر تلاشهای زیادی برای پیدا کردن آنتی بیوتیکهایی معطوف شده که باکتری نتواند در برابر آن مقاوم شود .(۸)
باکتریوسین ها، پپتید ها یا پروتئینهای آنتی میکروبیال ریبوزومی هستند که در دنیای میکروبی پراکنده هستند و توسط باکتریهای گرم مثبت و گرم منفی تولید می شوند، اغلب باکتریوسین ها اندازه کوچکی دارند ( ۲۰ تا ۷۰ اسید آمینه) و دارای خصوصیات کاتیونی می باشند که سلولهای هدف را با ناپایداری کامل پوشش غشای درونی و یا از
۱۱۱
مجله پژوهشهای سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران) جلد ۲۷، شماره ۱، ۱۳۹۳
طریق مکانیسمهای تهاجمی دیگراز قبیل فعالیت DNase، RNase و اختلال در سنتز پروتئینهای ضروری سلولهای هدف از بین می برند که در نهایت منجر به مرگ سلولی می شوند(.(۷ باکتریوسین ها سموم قوی هستند که به دلیل فعالیت کشندگی قوی ولی با طیف کشندگی محدود، مورد توجه خاص قرار دارند و نکته قابل توجه این است که باکتریوسین ها برای انسان سمی نیستند (۳) یا سمیت آنها بسیار کم می باشد .(۴) اغلب باکتریوسین ها معمولاً علیه گونه هایی که رابطه نزدیکی با استرین تولیدکننده دارند؛ فعالیت می کنند(.(۱۷ باکتریوسین ها اولین بار توسط A.Gratia در سال ۱۹۲۵ کشف شدند. او در حال تحقیق بر روی فرآیندی برای کشتن باکتریها بود که این امر منجر به پیشرفت آنتی بیوتیکها و کشف باکتریوسین ها گردید.
همه این یافته ها به چند سال اخیر محدود می گردد و این نشان دهنده اهمیت کشف باکتریوسین ها می باشد. او اولین کشف خود را کولیسین نامید زیرا باعث کشتن E.Coli گردید (“کولیسین” به معنی کشنده E.Coli می باشد) و جالب اینجاست که این باکتریوسین از خود E.Coli منشاء می گیرد. امروزه مشخص شده است که باکتریوسین ها یک خانواده بزرگ و متنوع از لحاظ عملکردی را شامل می شوند و در واقع سمومی هستند که در دودمانهای باکتریایی و آرکی آ یافت می شوند .(۱۶)
روشهای رده بندی باکتریوسین ها بسیار متفاوت می باشد از جمله بر اساس سویه تولید کننده، مکانیسم کشندگی
(مانند تشکیل منفذ و فعالیت نوکلئازی)، وزن مولکولی و شیمی مولکولی (پروتئینهای بزرگ، پلی پپتید ها و داشتن آمینواسیدهای غیرمعمول مانند لانتیونین ها)، نحوه تولید
(ریبوزومی، تغییرات پس ریبوزومی و غیرریبوزومی) رده بندی می شوند(.(۱۰ اغلب باکتریوسین ها در چند مورد از آنتی بیوتیکهای معمول متفاوتند: باکتریوسین ها یک طیف کشندگی محدودی دارند و بنابراین تنها برای باکتری که از لحاظ تاکسونمی خیلی به استرین تولیدکننده آن باکتریوسین نزدیک باشد سمی می باشند. از دیگر تفاوتهای
مهم میان باکتریوسین ها و آنتی بیوتیکها این است که اغلب باکتریوسین ها منشاء ریبوزومی دارند و ترکیبات پروتئین دار ریبوزومی می باشند. همچنین باکتریوسین ها قادرند در غلظتهای کم و در حد پیکومول مهار کنند در حالی که آنتی بیوتیکها در حد میکرومول مهار می کنند و در حقیقت این ویژگیها، اکثر باکتریوسین ها را از آنتی بیوتیکها متمایز می کنند(.(۶ تاکنون هیچ گزارشی از باکتریوسین مهارکننده زانتوموناس مشاهده نشده است، باکتریوسین Lashar DGH2 اولین باکتریوسین مهارکننده سویه های مختلف زانتوموناس عامل بیماری شانکر مرکبات در ایران و سایر نقاط جهان می باشد. به طور کلی اهدافی که از این تحقیق مورد نظر بوده است عبارتند از شناسایی باکتری مهارکننده رشد باکتری زانتوموناس، اثربخشی این باکتری بر روی باکتری عامل مولد شانکر، امکان دستیابی به باکتریوسین تولیدی توسط باکتری مورد نظر برای مطالعات آتی و بررسی امکان کاهش جمعیت عامل بیماری شانکر مرکبات و کنترل بیولوژیکی بیماری می باشد و همچنین اصول کاربردی از قبیل مبارزه بیولوژیک با آفات و افزایش راندمان تولید مرکبات، بهبود کیفیت میوه از طریق جلوگیری از بروز آفات و بهبود بازار مرکبات از این مطالعه متصور می باشد.
مواد وروشها
سویه های باکتریایی و محیط کشت:اندامهای سالم و آلوده مرکبات و همچنین نمونه های خاک و آب از مناطق مختلف استان سیستان و بلوچستان ( شهرهای نیک شهر، ایرانشهر، چابهار، جکیگور، سرباز، راسک، قصرقند) جمع آوری گردید. بعد از انتقال به آزمایشگاه بلافاصله عملیات جداسازی آغاز گردید جداسازی سویه های مختلف باکتریایی بر طبق روش مرسوم در باکتری شناسی انجام گرفت (۱۱) و جهت تولید باکتریوسین علیه سویه های مختلف باکتری زانتوموناس ۱۲۰) سویه مختلف) غربالگری انجام گردید. همه سویه های شاخص و تولیدکننده در
۱۱۲
مجله پژوهشهای سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران) جلد ۲۷، شماره ۱، ۱۳۹۳
محیط کشت مایع (Nutrient Broth) NB کشت داده شدند و از محیط کشت جامد (Nutrient Agar) NA استفاده گردید. از همه سویه های بیماریزا (شاخص) و همچنین سویه های تولیدکننده استوک با گلیسرول ۲۰درصد تهیه گردید و در -۷۰ درجه سانتی گراد نگه داری شدند.
جداسازی سویه تولیدکننده: بعد از اینکه ۵۰۰ سویه باکتریایی مختلف از منبع باکتریایی مذکور جداسازی و در محیط کشت مایع NB پیش کشت داده شد و بعد از مدت
۲۴ ساعت که از کشت آنها سپری شد هرکدام جداگانه بر روی دیسکهای مخصوص منتقل و با روش نوین DD-
Disc Diffusion-Agar Well Diffusion ) AWDA (Assay کشت دیسکی داده شدند، بدین ترتیب که سوسپانسیونی از هر باکتری بیماریزا با کدورتی معادل نیم مک فارلند در محیط کشت مایع NB تهیه و به وسیله سواپ استریل روی سطح پلیت محتوی ۱۵میلی لیتر NA
تلقیح گردید سپس دیسک آغشته به ۱۰ میکرولیتر از باکتری تولیدکننده روی سطح پلیت قرار داده شد. پلیتها در دمای ۳۵درجه سانتی گراد آنکوبه و بعد از گذشت ۲۴
ساعت تشکیل هاله عدم رشد بررسی گردید. کلنی تولیدکننده هاله (سویه تولیدکننده) از دیگر کلنیها جدا و جهت بررسیهای آتی از آن استوک تهیه گردید و تستهای مورفولوژیکی (میکروبیولوژیکی) و بیوشیمیایی آن انجام شد.
تشخیص و شناسایی سویه جدا شده: سویه جدا شده برای آزمونهای بیوشیمیایی از قبیل ژلاتین، سیترات، MR و
سایر فاکتورها مورد ارزیابی قرار گرفت و تستهای میکروبی نیز طبق پروتکلهای استاندارد انجام شد. شناسایی بیشتر با توالی یابی ۱۶srDNA و به دنبال آن آنالیز فیلوژنتیکی جهت شناسایی سویه تولید کننده انجام گرفت(.(۱۲
تولید باکتریوسین: پیش کشت باکتری تولید کننده بعد از گذشت مدت ۲۴ ساعت آنکوباسیون، سانتریفیوژ گردید(در
دور ۷۰۰۰ × g و به مدت ۱۵دقیقه) و مایع رویی از فیلتر غشایی ۰/۲ میکرومتر عبور داده شد و مایع جمع آوری شده جهت بررسیهای آتی در یخچال با دمای ۴ درجه سانتی گراد نگه داری گردید.
سنجش فعالیت و تعیین طیف آنتی میکروبیال: روشهای
مختلفی جهت سنجش فعالیت آنتی میکروبیال باکتریوسین ها وجود دارد که در این تحقیق از دو روش جاسازی در دیسک((Disc Diffusion و جاسازی در چاهک آگار((Agar-Well Diffusion Assay و همچنین از روش نوین DD-AWDA استفاده گردید. در روش Disc diffusion بعد از تهیه پلیتهای محتوی محیط کشت باکتریایی NA، سطح پلیت با ۱۰۰ میکرو لیتر از باکتری هدف تلقیح ( قبلا از باکتری هدف، استاندارد ۰/۵مک فارلند آماده شد) و دیسکهای استریل بر روی محیط کشت جامد مورد نظر در پلیت قرار گرفتند و مقدار ۱۰
میکرولیتر از سوسپانسیون باکتری تولیدکننده بر روی دیسک گذارده شد. پلیتها به گرمخانه با دمای ۳۵ درجه سانتی گراد منتقل گردیدند و بعد از ۲۴ساعت تشکیل هاله بررسی گردید .(۱۳) در روش AWDA بعد از تهیه آگار نیمه جامد(۰/۵ درصد) مقدار ۱۰۰ مایکرولیتر از پیش کشت باکتریایی هدف در ۵ میلی لیتر از آن مخلوط شد و در یک پلیت جداگانه که قبلا دو سوم آن با محیط کشت جامد NA پر گردید افزوده و چاهکهایی به قطر ۵ میلی متر در آنها ایجاد و مقدار ۱۰۰ میکرولیتر از سویه تولیدکننده به هر چاهک اضافه شد و به گرمخانه با دمای
۳۵ درجه سانتی گراد منتقل و تشکیل هاله بعد از ۲۴
ساعت بررسی گردید .(۱۴)
استخراج DNA باکتری تولیدکننده: برای استخراج DNA
باکتری تولیدکننده از کیت استخراج DNA ژنومیک
(خریداری شده از شرکت Bioneer، کره جنوبی) استفاده شد و DNA خالص شده جهت نگه داری به یخچال با دمای -۲۰ درجه سانتی گراد منتقل گردید. در پایان برای
۱۱۳
مجله پژوهشهای سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران)
اطمینان از کیفیت DNA استخراج شده، جذب نمونه های خالص شده در طول موجهای ۲۶۰و ۲۸۰ نانومتر به وسیله دستگاه طیف سنج خوانده شد.
الکتروفورز :DNA پس از انجام مراحل فوق، برای مشاهده کیفیت DNA استخراج شده ۵ میکرولیتر از آن را روی الکتروفورز افقی ژل آگارز ۱ درصد (تهیه شده در بافر (TBE 1X برده و پس از رنگ آمیزی با اتیدیوم بروماید با کمک دستگاه GBOX HR عکس برداری صورت گرفت .(۱۵)
جدول-۱ برنامه دمایی و زمانی PCR
زمان(ثانیه) دما((°C مراحل شماره
۳۰ ۹۴ Denaturation 1
۹۰ ۵۶ Annealing 2
۳۰ ۷۴ Extension 3
۳۰۰ ۷۴ Final-Extension 4
– ۳۵ Cycle Count 5
جلد ۲۷، شماره ۱، ۱۳۹۳
جدول -۲ غلظتهای مخلوط PCR (این واکنش در حجم نهایی ۲۵ µl
تهیه شد)
حجم به l غلظت مواد
۱/۵ ۱/۵ mM MgCl2
۲/۵ ۱۰ X Reaction buffer
۱ ۵ mM dNTP(mix)
۱ ۲۰ pM Reverse primer
۱ ۲۰ pM Forward primer
۲ ۷۰ng/l DNA template
۱۵/۵ – ddH2O
۰/۵ ۱ unit Taq DNA
polymerase
واکنش PCR و : ۱۶srDNA برای تکثیر ۱۶srDNA
مربوط به باکتری تولیدکننده از روش PCR استفاده شد(.(۹
جداول ۱ و ۲ برنامه به کار گرفته شده در دستگاه ترموسیکلر و مخلوط واکنشها را نشان می دهد. ترادف آغازگر forward و reverse به کار گرفته جهت این مطالعه
در جدول ۳ آمده است.
اشتراک‌گذاری:
- در صورتی که به هر دلیلی موفق به دانلود فایل مورد نظر نشدید با ما تماس بگیرید.
