دانش رسان |
مرکز علم و دانش کشور مقاله افزایش بیان ژن P5CS در گیاهچه زیتون تحت تنش شوری
در حال بارگذاری
توجه : به همراه فایل word این محصول فایل پاورپوینت (PowerPoint) و اسلاید های آن به صورت هدیه ارائه خواهد شد
مقاله افزایش بیان ژن P5CS در گیاهچه زیتون تحت تنش شوری دارای ۸ صفحه می باشد و دارای تنظیمات در microsoft word می باشد و آماده پرینت یا چاپ است
فایل ورد مقاله افزایش بیان ژن P5CS در گیاهچه زیتون تحت تنش شوری کاملا فرمت بندی و تنظیم شده در استاندارد دانشگاه و مراکز دولتی می باشد.
توجه : در صورت مشاهده بهم ریختگی احتمالی در متون زیر ،دلیل ان کپی کردن این مطالب از داخل فایل ورد می باشد و در فایل اصلی مقاله افزایش بیان ژن P5CS در گیاهچه زیتون تحت تنش شوری،به هیچ وجه بهم ریختگی وجود ندارد
بخشی از متن مقاله افزایش بیان ژن P5CS در گیاهچه زیتون تحت تنش شوری :
مقدمه
یکی از مشکلات موجودات زنده در محیطهای شور و الکتریکی مثل گلیسین، بتائین و دی متیل سولفونیوم
خشک، حفظ مقدار آب درونی است. گیاهان برای مقابله با پروپیونات (DMSP) می باشند ۶) و .(۱۳ تجمع پرولین در
این مشکل درسیتوپلاسم خود ترکیباتی به نام اسمولیتها را گیاهان تحت تنش، نتیجه تنظیم متقابل در دو مسیر است
انباشته می کنند. این ترکیبات باید سمی نبوده و در که روی هم رفته چرخه پرولین را تشکیل می دهد: -۱
فرآیندهای متابولیکی مداخله ننمایند و در غلظتهای بالا افزایش بیان آنزیمهای مسیر سنتز پرولین P5CS) ، (P5CR
ساختار و عملکرد پروتئینها را تغییر ندهند. اسمولیتها شامل -۲ کاهش فعالیت تجزیه ای پرولین P5CS .(7)، آنزیم
قندهایی مثل سوکروز و فروکتوز، قندهای الکلی مثل کلیدی در مسیر بیوسنتز پرولین در گیاهان می باشد و یک
گلیسرول و اینوزیتول متیله شده، قندهای کمپلکس مثل آنزیم دو عملکردی است که دو گام ابتدایی در مسیر
ترهالوز، رافینوز و فروکتان، آمینواسیدهای خاص یا بیوسنتز پرولین را کاتالیز می کند ۳) و .(۱۲ در این مطالعه
مشتقات آنها مثل پرولین و اکتوین، متابولیتهای دارای بار با بررسی و شناسایی اپیتوپهای سطحی آنزیم P5CS و
۱۱۹
مجله پژوهشهای سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران) جلد ۲۷، شماره ۱، ۱۳۹۳
تولید پلی پپتید بر مبنای مطالعه اپیتوپها و تزریق آن در یک حیوان مناسب و در نهایت با استفاده از آنتی بادیهای پلی کلنال بر علیه ژن P5CS به بررسی میزان بیان ژن P5CS
از طریق ایمونولوژیکی در گیاهچه زیتون در دو شرایط تنش وعدم تنش پرداخته شد.
مواد و روشها
گونه مورد مطالعه در این تحقیق رقم زرد زیتون با نام علمی Olea europaea می باشد که از منطقه گیلوان جمع آوری شده است.
کشت گیاه : پس از جدا کردن برون برهای گوشتی میوه ها، میان برهای سخت و چوبی بذرها به صورت مکانیکی شکسته شده و درون برها (رویان همراه با اندوسپرم)
جهت استریل شدن در زیر هود به مدت یک دقیقه در اتانول ۷۰ درصد و سپس ۲۰ تا ۳۰ دقیقه در هیپوکلریت سدیم ۵۰ در صد قرار داده شدند و در ادامه پنج بار شستشو با آب مقطر سترون انجام گرفت و دانه های سترون شده بر روی دو کاغذ صافی موجود در پتری سترون محتوی ۵ میلی لیتر آب مقطر سترون شده قرار گرفته و به مدت ۴۸ تا ۷۲ ساعت در دمای ۴ درجه سانتی گراد در تاریکی نگهداری شدند. سپس اندوسپرم ها توسط نوک اسکالپل از رویانها جدا شده و رویانهای کامل و بدون آسیب دیدگی بر روی محیط MS با غلظت ۱/۲
قرار داده شدند. این محیطهای کشت حاوی نمونه در اتاق کشت دمای ۲۵درجه سانتی گراد و شرایط ۱۶ ساعت روشنایی و ۸ ساعت تاریکی نگهداری شدند. پس از گذشت ۲ تا ۳ هفته نیمی از رویانهای دارای جوانه به محیط MS با غلظت ۱/۲ حاوی ۲۰۰ میلی مولار نمک انتقال داده شدند و پس از گذشت ۳ هفته از تنش شوری گیاهچه های سبز بعد از قطع ریشه هایشان بلافاصله به ازت مایع منتقل شدند و برای بررسیهای بعدی در فریزر
-۷۰ درجه سانتی گراد نگهداری شدند.
استخراج پروتئین: به روش Tsugita و همکاران (۱۹۹۶)
انجام شد .(۱۶)
سنجش میزان پرولین : به میزان ۱۰۰ میلی گرم برگ تازه از گیاهچه های تحت تنش شوری تهیه و در حضور نیتروژن مایع به صورت پودر در آمدند سپس ۱۰ میلی لیتر اسید سولفوسالیسیلیک ۳ درصد به نمونه ها اضافه شد.
محلول حاصل به مدت ۱۰دقیقه در ۱۳۰۰۰ دور در دقیقه سانتریفیوژ شد و ۲ میلی لیتر از محلول بالایی انتخاب شده و با ۲ میلی لیتر از اسیداستیک و۲ میلی لیتر محلول اسیدی نینهایدرین ( شامل ۱/۲۵ گرم نینهایدرین در ۳۰ میلی لیتر اسید استیک که پس از حل شدن با حرارت، ۲۰ میلی لیتر اسید اورتوفسفوریک به آن اضافه شده بود) مخلوط گردیده و به مدت یک ساعت در بن ماری ۱۰۰ درجه سانتی گراد جوشانیده شد. پس از این مدت برای جلوگیری از ادامه واکنش، لوله ها در مخلوط آب و یخ قرار گرفتند. پس از رسیدن به دمای اطاق، ۴ میلی لیتر تولوئن اضافه گردید و پس از به هم زدن با ورتکس شدت جذب نمونه ها در ۵۲۰ نانومتر در دستگاه اسپکتروفوتومتری اندازه گیری شد وبا استفاده از مقدار پرولینهای استاندارد وشدت جذب نوری آنها منحنی استاندارد رسم شد و میزان پرولین در گیاهچه های تحت تنش محاسبه گردید .(۲)
تهیه آنتی بادی پلی کلنال: با توجه به نتایج حاصل از بررسی Nanjo و همکاران (۱۱)(۱۹۹۹)، ۱۵ اسید آمینه انتهای آمین AtP5CS [EELDRSRAFARDVKR] مربوط به آرابیدوپسیس تالیانا به عنوان اپیتوپ برای سنتز آنتی بادی تعیین شد وسپس سنتزپپتید توسط شرکت سیگما انجام گردید. در ادامه ۳۰۰ میکروگرم پپتید سنتز شده را در
(Phosphate buffer saline) PBS حل کرده وهم حجم آن ادجوانت کامل فروند زده و به دو ناحیه از پشت خرگوش به طریقه زیر پوستی تزریق شد. تزریق دوم یک ماه بعد انجام شد (یادآوری اول) به این صورت که ۳۰۰ میکروگرم
۱۲۰
مجله پژوهشهای سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران)
پپتید سنتزشده در PBS حل شد و هم حجم آن ادجوانت ناقص فروند زده وتزریق انجام شد. یادآوری دوم نیز یک ماه بعد مشابه یادآوری اول انجام شد. دو هفته بعد خونگیری انجام و سرم ( با رقت(۱/۱۰۰۰ برای تأییدات ایمونولوژیکی تهیه گردید.
تشخیص ایجاد پادتن از طریق دات بلاتینگ : پپتید سنتز شده حکم پادگن را دارد لذا به صورت لکه هایی روی کاغذ نیتروسلولز قرار داده شد پس از تثبیت پپتید بر روی کاغذ نیتروسلولز در دمای ۳۷ درجه سانتی گراد، از طریق دات بلاتینگ، پادتن تولید شده با پادگن واکنش داده شد.
شناسایی پروتئین مربوط به P5CS توسط پادتن از
طریق وسترن بلاتینگ : نمونه پروتئینی استخراج شده از گیاهچه تحت تنش و گیاهچه شاهد در شرایط غیر تنش بر روی ژل ۱۲/۵ در صد SDS-PAGE تزریق شد. پس از خاتمه عمل رانینگ، وسترن بلاتینگ برای شناسایی میزان بیان پروتئین مربوط به P5CS در گیاهچه زیتون در دو شرایط تنش وغیر تنش انجام گردید. آنالیز وسترن
جلد ۲۷، شماره ۱، ۱۳۹۳
بلاتینگ به روش Nanjo و همکاران (۱۹۹۹) انجام شد
.(۱۱)
تجزیه و تحلیل آماری داده ها: داده ها با استفاده از تست آنووا وآزمون دانکن مورد بررسی قرار گرفتند.
نتایج
نتایج سنجش میزان مقاومت گیاه زیتون در محیط حاوی
۲۰۰mM نمک: گیاهچه های موجود در محیط MS با غلظت ۱/۲ حاوی ۲۰۰ میلی مولار نمک رشد کمتری را نسبت به گیاهچه های شاهد در محیط MS با غلظت ۱/۲ (شرایط غیر تنش) نشان دادند . شکل ۱a) و .(۱b
سنجش میزان پرولین: سنجش پرولین نشان داد که میزان پرولین در گیاهچه زیتون طی تنش افزایش می یابد (شکل
۲ و جدول .(۱
بر اساس آنالیز آنووا وتست دانکن میانگین میزان پرولین در غلظتهای نمکی صفر ، ۱۰۰ و ۲۰۰ با هم اختلاف معنی دار دارند .
شکل ( a ) – 1 گیاهچه زیتون در محیط کشت MS با غلظت ( b ) 1/2 گیاهچه زیتون در محیط کشت MS با غلظت ۱/۲حاوی ۲۰۰ میلی مولار نمک
جدول – ۱ میزان پرولین درغلظتهای نمکی صفر ،۱۰۰ و ۲۰۰ میلی مولارنمک در گیاهچه زیتون
۲۰۰ ۱۰۰ ۰ NaCl (mM)
۳۷۱۴/۴۶±۱۳۲/۸۷ ۲۲۲۸/۴۱±۶۳/۷۷ ۲۵۰/۷۷±۲/۰۳ تست
۱۲۱
مجله پژوهشهای سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران) جلد ۲۷، شماره ۱، ۱۳۹۳
شکل -۲ میزان پرولین در گیاهچه شاهد و گیاهچه های تحت تنش شوری در غلظتهای ۱۰۰ و ۲۰۰ میلی مولار نمک
نتایج حاصل از دات بلاتینگ : با استفاده از تکنیک دات نتایج حاصل از آنالیز وسترن بلاتینگ: برای اطمینان
بلاتینگ مشخص شد که پادتن ایجاد شده قدرت شناسایی بیشتر از نتیجه به دست آمده تکنیک وسترن بلاتینگ انجام
پروتئین مربوط به P5CS را دارد. همان طور که در شکل شد. همان طور که در شکل ۴ مشخص است باند مربوط
۳ مشخص است در کنار نمونه مربوط به پپتید سنتز شده، به نمونه تحت تنش بسیار پررنگ می باشد در حالی که
عصاره پروتئینی مربوط به گیاهچه های زیتون در شرایط باند مربوط به نمونه ای که در شرایط غیر تنش قرار داشته
تنش وعدم تنش نیزمورد آنالیز دات بلاتینگ قرار گرفتند. به صورت نازک و کم رنگ نمایان شده است. تمام این
نتایج نشان می دهد که در گیاه تحت تنش زیتون، حلقه نتایج بازگو کننده این مطلب است که در گیاه زیتون تحت
رسوبی تشکیل شده بسیار پررنگتر از حلقه رسوبی مربوط تنش اسمزی، سطح بیان P5CS بالا می رود.
به گیاه شاهد در شرایط غیر تنش می باشد.
شکل -۳ آنالیز دات بلاتینگ شماره :۱پپتید P5CS شماره :۲
پپتید کنجوگه با BSA (بووین سرم آلدئید ) شماره :۳ گیاهچه
زیتون در شرایط غیر تنش شماره :۴ گیاهچه زیتون تحت شرایط
شکل -۴ آنالیز وسترن بلاتینگ. شماره :۱ گیاهچه شاهد شماره :۲
تنش
گیاهچه تحت تنش
اشتراک‌گذاری:
- در صورتی که به هر دلیلی موفق به دانلود فایل مورد نظر نشدید با ما تماس بگیرید.
