تحقیق مطالعه کارآیی فن‌آوری داس-الایزا در بهینه‌سازی مبارزه شیمیایی با بیماری بلاچ برگی گندم ناشی از Septoria tritici

توجه : به همراه فایل word این محصول فایل پاورپوینت (PowerPoint) و اسلاید های آن به صورت هدیه ارائه خواهد شد

 تحقیق مطالعه کارآیی فن‌آوری داس-الایزا در بهینه‌سازی مبارزه شیمیایی با بیماری بلاچ برگی گندم ناشی از Septoria tritici دارای ۲۴ صفحه می باشد و دارای تنظیمات و فهرست کامل در microsoft word می باشد و آماده پرینت یا چاپ است

فایل ورد تحقیق مطالعه کارآیی فن‌آوری داس-الایزا در بهینه‌سازی مبارزه شیمیایی با بیماری بلاچ برگی گندم ناشی از Septoria tritici  کاملا فرمت بندی و تنظیم شده در استاندارد دانشگاه  و مراکز دولتی می باشد.

توجه : توضیحات زیر بخشی از متن اصلی می باشد که بدون قالب و فرمت بندی کپی شده است

بخشی از فهرست مطالب پروژه تحقیق مطالعه کارآیی فن‌آوری داس-الایزا در بهینه‌سازی مبارزه شیمیایی با بیماری بلاچ برگی گندم ناشی از Septoria tritici

چکیده  
مقدمه  
مواد و روش ها  
نتایج و بحث  
منابع  

بخشی از منابع و مراجع پروژه تحقیق مطالعه کارآیی فن‌آوری داس-الایزا در بهینه‌سازی مبارزه شیمیایی با بیماری بلاچ برگی گندم ناشی از Septoria tritici

۱ – ترابی، م. ۱۳۵۸ بررسی بیولوژی و پاتولوژی شبه گونه Septoria tritici روی گندم در مناطق شمالی و جنوبی ایران. پایان نامه کارشناسی ارشد. دانشگاه تهران

۲ – عظیمی، ح. ۱۳۷۶ بررسی اختلاف بیماریزایی قارچ Septoria tritici عامل بیماری سپتوریوز برگ گندم در ایران و تعیین مقاومت ارقام امیدبخش نسبت به ایزوله های با ویرولانس بالا. گزارش نهایی طرح پژوهشی مؤسسه تحقیقات آفات و بیماریهای گیاهی

۳ – Binder, A., Etinne, L., Beck, J., Speich, J., and Yound, J. 1995. Practical value of crop disease diagnostic techniques. in: Heitt et al. (eds.) A Virtual Role for Fungicides in Cereal Protection, SCI & BCPC Proceeding, UK, 231-

۴ – Etinne, L. 1998. Crop Diseases Diagnostic ()

۵ – Etinne, L. 1998. “On-site” (ELISA) Diagnostics kit for the detection of Septoria spp. in Wheat ()

۶ – Etinne, L. 1998. Wheat septoria: lab-based (ELISA) diagnostics kit for detection and qualification of Septoria spp. in wheat ()

۷ – Eyal, Z. 1999. The septoria/stagonospora blotch diseases of wheat: past, present and future. 177-182. in: Eyal, Z. 1999. Septoria and Stagonospora diseases of cereals: A comparative perspective. 1-

۸ – Lucas, J. A., P. Bowyer, and H. M. Anderson. 1999. Septoria on Cereals: A study of pathosystems. CAB International, Wallingford, UK

۹ – Hollomon, D. W., B. Fraaije, E., Rohel, J. Buttler and S. Kendall. 1999. Detection and diagnosis of septoria diseases: The problem in practice. 271-284. in: Septoria on cereals: A study of pathosystems. J. A. Lucas, P. Bowyer, and H. M. Anderson. 1999. CAB International, Wallingford, UK

۱۰ – Eyal, Z., Sharen, A. L., Prescott, J. M. and van Ginkel. 1987. The Septoria disease of wheat. Concepts and methods for disease management. CIMMYT. Mexico. 46pp

۱۱ – Septotest. ELISA test for the presymptomatic detection of Septoria tritici.A LAC – Biotest product, manufactured under NOVARTIS licence. 5 pp

۱۲ – Smith, J. A., Leadbeater, A. J., Scott, T. M. 1994. Application of diagnostics as a forecasting tool in British agriculture, proceedings of the 1994 Brighton crop protection conference- pests and diseases 1: 277-

۱۳ – Mittermerier, L., Dereck, W., West, S. J. E., Miller, S. A. 1990. Field result with a diagnostic system for the identification of Septoria nodorum and Septoria tritici. Proceedings of the 1990 Brighton crop protection conference-pest and disease 2: 757-

۱۴- Miller, S. A., Rittenburg, J. H., Petersen, F. P. and Grothous, G. D. 1988. Application of rapid, field, field-usable immunoassays for the diagnosis and monitoring of fungal pathogens. in: Proceeding of the 1988 Brighton crop protection conference-pest and disease 2: 795-

چکیده

        پیش‌آگاهی از وقوع بیماری بلاچ برگی گندم ناشی از Septoria tritici در تنظیم و طراحی دقیق مبارزه شیمیایی بسیار حائز اهمیت است. یکی از روشهای شناسایی این بیماری پیش از بروز علایم، استفاده از فن‌آوری ایمنی‌سنجی است. در این تحقیق اهمیت بهره‌گیری از این فن‌آوری در تعیین نوع، مقدار مصرف قارچکش و زمان سمپاشی مورد بررسی قرار گرفته است. برای این منظور در ۴۴ ظرف کاشت، گندم رقم روشن کاشته شد. گیاهچه‌ها در مرحله ۱۲ روزگی با سوسپانسیونی از اسپوریدی‌های قارچ مایه زنی شدند. ۲۰ ظرف کاشت پیش از بروز علایم بیماری و ۲۰ ظرف دیگر پس از بروز آن با سه میزان ۲، ۱ و ۵/۰ درهزار از قارچکش‌های پروپیکونازول و سایپروکونازول با سه تکرار سمپاشی شدند. چهار ظرف کاشت باقیمانده در هر دسته نیز بعنوان شاهد با آب معمولی تیمار گردید. این طرح بصورت طرح فاکتوریل و در قالب طرح کاملاً تصادفی به اجرا درآمد. چگالی نوری نمونه‌های برگی پس از عصاره گیری و انجام آزمون الایزا تعیین و به مقادیر واحدهای پادگنی قارچ تبدیل شده و تاثیر هر یک از تیمارها بر این مقادیر مورد مقایسه قرار گرفت. نتایج نشان داد که بین مقادیر درصد کاهش واحدهای پادگنی در صورت اعمال سمپاشی پیش و پس از بروز علایم اختلاف معنی داری وجود دارد. همچنین درصورت استفاده از قارچکش پروپیکونازول و سایپروکونازول با پیش‌آگاهی بیماری می‌توان میزان سمپاشی و در نتیجه هزینه سمپاشی با هر دو قارچکش را تا ۴ برابر کاهش داد. اختلاف معنی داری بین درصد کاهش واحدهای پادگنی در دو قارچکش سایپروکونازول و پروپیکونازول دیده نشد. استفاده از این فن‌آوری علاوه بر تعیین زمان دقیق اعمال تیمارها، به کاهش قابل توجه میزان سمپاشی با قارچکش‌ها و تأثیر هرچه بیشتر آنها خواهد انجامید

مقدمه

         یکی از تهدیدهای عمده گندم‌کاری در کشور، شیوع و گسترش فزاینده بیماری بلاچ برگی گندم ناشی از  S. tritici است (۱و۲). دلایل عمده افزایش این بیماری، رواج کاشت ارقام گندم مقاوم به زنگها و سفیدک پودری ولی حساس به بیماری‌های سپتوریایی، از بین نبردن بقایای گیاهی، افزایش مصرف کودهای ازته و مقاومت عوامل بیماریزا به قارچکش‌ها عنوان شده است (۷و۸و۱۰). یکی از جنبه‌های حفاظت گیاهان از آسیب عوامل بیماریزا، پیش‌آگاهی و تشخیص آلودگی و عامل بیماریزا پیش از بروز علایم است. اینکار، درواقع به تصمیم‌گیری در انتخاب نوع قارچکش، زمان و تعداد سمپاشی‌ها کمک خواهد نمود. بعبارت دیگر، استفاده از این روش که جهت سنجش آستانه بیماری انجام می‌گیرد، در راستای کاربرد بهینه قارچکش ها براساس مدیریت تلفیقی آفات از اهمیت زیادی برخوردار می‌باشد (۶)

        علی‌رغم وجود گندم‌هایی حامل ژن‌های مقاومت به بیماری سپتوریوز برگی، هنوز کنترل این بیماری با استفاده از قارچکش‌ها انجام می‌شود و در این راستا، قارچکش‌های تریازولی عملاً نتایج موفقیت‌آمیزی درپی‌داشته‌اند. انتخاب نوع و مقدار سم بکار گرفته شده در هر مزرعه برحسب شرایط اقلیمی، رقم و مرحله رشدی محصول متفاوت خواهد بود (۱۰). از نقطه نظر همه‌گیری‌شناسی بیماری، مرحله‌ای از رشد میزبان که تعیین کننده اِعمال تیمارهای معالجه‌ای علیه این بیماری است، زمان مشخصی نداشته و از این لحاظ اقدام ناآگاهانه به سمپاشی نیز موفقیت اتفاقی و ناپایدار خواهد داشت (۷). در مراحل اولیه آلوده شدن گیاه، علایم دقیقی حاکی از بروز این بیماری در گیاه قابل رؤیت نیست. از طرفی، تأثیر حتی مؤثرترین سم تریازولی نیز به دوره گسترش هیف S. tritici در بافت میزبان (۱۴ الی ۲۱ روز) محدود می‌شود. بعبارت دیگر پس از پیدایش پیکنید‌ها در سطح برگ هیچ‌ یک از سموم تریازولی موجود تأثیر چندانی در کنترل بیماری ندارد (۹). ازاینرو، شناسایی بیماری سپتوریوز در گیاه پیش از بروز علایم و پیدایش پیکنیدها اهمیت بسیاری دارد، چرا که به انتخاب زمان دقیق سمپاشی، نوع و مقدار مناسب قارچکش مورد استفاده، کمک نموده و کنترل بهتر بیماری را درپی‌خواهد داشت (۹)

      یکی از رایج‌ترین فن‌آوری‌ها در تشخیص این بیماری پیش از بروز علایم، روش داس‌الایزا۱ می‌باشد که اساس کار آن اتصال آنتی‌بادی ویژه به آنتی‌ژن خود بصورت پایدار و کاملاً اختصاصی است (۱۲،۱۴). این روش اکثراً در تشخیص بیماری‌هایی که دوره نهفتگی طولانی‌تری دارند، بکار می‌رود (۳،۱۴). با استفاده از این روش، عامل بیماری حتی در هنگامیکه اولین سلولهای آن شروع به رخنه در گیاه می‌کنند، قابل شناسایی و سنجش است. در این روش از پادتن‌های فوق العاده اختصاصی استفاده می‌شود که محلهای پروتئین خارج سلولی عامل بیماریزا را شناسایی می‌کنند. واکنش بین پادگن و پادتن بسیارحساس و اختصاصی بوده و نتیجه آن به رقم و مرحله رشدی میزبان، محل قرارگیری و سن برگ، سمپاشی‌های قبلی و شرایط محیطی بستگی ندارد (۱۲)

برای نخستین بار در سال ۱۹۸۸ شرکت کشاورزی سیبا۱ اقدام به تولید پادتن برای S. tritici و Stagonospora nodorum نموده و آن را ساعت سپتوریای۲ نامید (۳ و۱۲). در سال ۱۹۸۹ شرکت نوارتیس، برنامه پیش آگاهی سپتوتست۳ را بعنوان ابزاری پیشرفته و مدرن جهت شناسایی دقیق بیماریهای سپتوریایی در گندم طراحی و ارائه نمود که در حال حاضر در کشورهایی نظیر انگلستان، فرانسه، آلمان، سوئد و ایالات متحده رواج یافته است. همچنین سیستم پیش‌آگاهی دیگری در فرانسه بنام پرسپت۴ نیز به همین منظور بوجود آمده است (۳). شرکتهای تولید کننده مواد شیمیایی کشاورزی مثل سیبا، نوارتیس۵ و دوپان۶ نیز فعالیتهای گسترده‌ای را درخصوص تشخیص مولکولی بیماریهای مهم ازجمله بیماری سپتوریوز گندم آغاز نموده‌اند (۵و۶). هدف از این آزمایش ارزیابی روش ایمنی سنجی جهت استفاده بهینه از آفتکش‌های پروپیکونازول و سایپروکونازول در مبارزه با بلاچ برگی گندم می‌باشد

         مواد و روش ها

         این تحقیق در گلخانه تحقیقاتی دانشگاه فردوسی مشهد و در سال ۱۳۷۹ انجام شد. آزمایش در قالب طرح فاکتوریل ۲×۲×۴ با سه تکرار و طرح پایه کاملاً تصادفی در شرایط گلخانه به اجرا درآمد. در ۴۴ ظرف کاشت چوبی به ابعاد تقریبی ۲۵ × ۵۰ و عمق ۱۵ سانتیمتر محتوی نسبت مساوی از خاک بکر و کود حیوانی، بذر گندم رقم روشن در دو ردیف به فاصله ۱۵ سانتیمتر از هم و در هر ردیف تعداد ۱۰ بذر در فواصل ۵ سانتیمتری بدون ضدعفونی کاشته شدند. جدایه قارچی F_۱۷ از مزارع گندم اطراف شهرستان فردوس از برگهای مبتلا به بلاچ برگی گندم جداسازی و S. tritici تشخیص داده شد (۱۰). مایه آلودگی قارچ از محیط کشت مایع سوکروز – مخمر (سوکروز ۱۰ گرم، عصاره مخمر۱۰ گرم و آب مقطر۱۰۰۰ میلی لیتر) که بمدت ۸ روز در دمای ۲۰ درجه سانتیگراد روی دستگاه تکاندهنده دوّار قرار داده شده بود، بدست آمد. سوسپانسیونی به غلظت ۱۰^۶ اسپوریدی در هر میلی لیتر که با استفاده از یک لام گلبول شمار تنظیم شده بود، تهیه گردید و به ازای هر لیتر از این سوسپانسیون یک میلی لیتر ماده کاهنده کشش سطحی توین۲۰ (‏Tween20) اضافه گردید. گیاهچه‌ها در مرحله ۱۲ روزگی با کشیدن پنبه استریل آغشته به سوسپانسیون اسپوریدی بر برگها مایه زنی شدند. گیاهان پس از ۳ روز نگهداری در زیر یک پوشش پلاستیکی، در شرایط دمایی ۳±۲۲ درجه سانتیگراد با برداشتن پوشش‌ها نگهداری شدند

       بسترهای کاشت بدو دسته ۲۲ تایی تقسیم و دسته اول ۱۰ روز پس از مایه‌زنی و پیش از بروز علایم بیماری و دسته دیگر پس از بروز علایم بیماری و بمحض پیدایش پیکنیدها با سه میزان ۲، ۱ و ۵/۰ در هزار از سموم پروپیکونازول (Tilt^®,۲۵۰ EC, novartis) و سایپرکونازل (Alto^®, ۲۵۰ EC, novartis) در سه تکرار با مه‌پاش دستی سمپاشی شدند. چهار ظرف کاشت باقیمانده در هر دسته نیز بعنوان شاهد با آب معمولی تیمار شدند

       دو عدد کیت کامل تشخیصی S. tritici با امکان انجام ۱۷۶ آزمون از شرکت ال. ای. سی – بیوتست۱ فرانسه خریداری گردید. نمونه برداری‌ها در هر دسته، پس از مایه زنی و پیش از سمپاشی بطور یک در میان، از برگهای دوم و سوم ردیف کاشت و یک هفته پس از اِعمال سمپاشی‌ها از برگهای سوم و دوم انجام شد. بدین‌ترتیب درصورتیکه برگ دوم یک گیاه برای آزمون اول انتخاب می‌شد، برگ سوم آن نیز برای آزمون دوم مورد استفاده قرار گرفت و برعکس. آزمون الایزا در دو مقطع زمانی مختلف برای نمونه‌های دسته اول با کیت شماره ۱ و دسته دوم با کیت شماره ۲ انجام شد. کیت ‌تشخیصی سپتوتست اختصاصاً برای تشخیص   S. tritici طراحی شده و عملکرد آن بسیار سریع و حساس می‌باشد. این کیت شامل ۹۶ چاهک در ۱۲ ستون (۱ تا ۱۲) و ۸ ردیف (A تا H) می‌باشد. چاهکهای ستون ۱ شامل شاهدهای استاندارد مثبت و منفی می‌باشند. در این چاهکها مقادیر پادگنی معینی در پیوند با پادتن قرار دارند و شاهدی برای اطمینان از سلامت کیت و نیز وسیله‌ای برای ارزیابی آزمون نمونه‌ها می‌باشد (۱۱)

       نمونه‌های برگی جمع‌آوری شده از هر یک از بسترهای کاشت به قطعات کوچکی تقسیم و هر کدام بطور جداگانه بکمک یک هاون چینی تمیز و همراه با بافر استخراج نمونه (۱ میلی لیتر بافر به ازای هر گرم نمونه برگی) عصاره گیری شد (۱۱). ۱۰۰ میکرولیتر از هر عصاره‌ پس از عبور دادن از پارچه ململ دو لایه، به کمک یک میکروپیپت تک کاناله با دو تکرار در چاهکهای میکروپلیت ریخته شـده و میکروپلیت به مدت ۱۵ دقیقـه در دمای اطـاق روی یـک شیکر دورانی با سرعت ۲۵۰ دور در دقیقه قرار داده شد. پس از این مرحله پوشش پلاستیکی چاهکهای ستون ۱ یعنی شاهدهای استاندارد مثبت و منفی برداشته شده و محتویات کلیه چاهکها تخلیه و هر چاهک چهار بار با ۴۰۰ میکرولیتر از بافر شستشو شسته شد (۱۱). با استفاده از یک میکروپیپت ۸ کاناله ۱۰۰ میکرولیتر کانجوگیت۱ (پیوندی از پادتن و آنزیم نشاندارشده) به هر چاهک اضافه شد. مراحل تکان و شستشو تکرار و ۱۰۰ میکرولیتر محلول بستره  به هر چاهک اضافه شد (۱۱). میکروپلیت بمدت ۱۰ دقیقه در دمای اطاق و در تاریکی با همان دور روی شیکر قرار داده شد و بلافاصله مقادیر چگالی نوری هر یک از چاهکها با استفاده از دستگاه  الایزا – خوان۲ در طول موج۶۲۰ نانومتر خوانده شد

۱ – DAS ELISA (Double Antibody Sandwich – Enzyme Linked Immunosorbent Assay)

۱ – Ciba Agriculture

۲ – Septoria Watch

۳ – SEPTOTEST

۴ – Presept

۵ – Novartis

۶ – Dupont

۱ – LAC- Biotest

۱ – Conjugate

۲ – ELISA Reader